Valores normales de NT-proBNP en perros sanos de distinta edad, sexo y talla

Los péptidos natriuréticos participan en el control de la homeostasis cardiovascular y renal. El objetivo de este estudio fue analizar la asociación entre la concentración de NT-proBNP y edad, sexo y talla en perros sanos. La muestra consistió en 159 caninos –80 machos y 79 hembras, 80 menores de 7 años y 79 mayores de 7 años, 53 de talla pequeña (<12 kg)– 53 de talla mediana (12-25 kg) –53 de talla grande (>25 kg)– con condición corporal 2.5-3.5 (score de 1-5). Se consideraron perros sanos a los que presentaron exploración clínica y estudios complementarios –presión arterial sistémica, electrocardiografía, radiología torácica, ecocardiografía, hematología y bioquímica sérica– dentro de parámetros normales. El análisis estadístico se realizó mediante un software público R&R Commander (Rcmdr), versión i386-3.0.1. La concentración media de NT-proBNP fue 260.28 pmol/l ± 135.48 pmol/l. Se observaron diferencias significativas para sexo (machos: 281.31 pmol/l ± 144.84, hembras: 238.99 pmol/l ± 123.52, p = 0.0392) y edad (<7 años: 235.19 pmol/l ± 119.72, >7 años: 285.69 pmol/l ± 146.97, p = 0.0124), pero no para talla (<12 kg: 235.78 pmol/l ± 129.18, 12-25 kg: 281.85 pmol/l ± 134.34, >25 kg: 263.21 pmol/l ± 142.46, p = 0.183). La concentración de NT-proBNP es afectada por la edad y el sexo, pero no por la talla, estas diferencias deben considerarse en condiciones de salud y enfermedad.

Las enfermedades cardíacas representan el 11.3 % de las patologías presentes en perros¹, correspondiendo 65-70 % a patologías valvulares, 15-20 % a miocárdicas y el resto a otras cardiopatías². En las últimas décadas, se ha prestado especial atención a la utilización de biomarcadores para evaluar el estado y funcionamiento del aparato cardiovascular³. Los péptidos natriuréticos son una familia de hormonas⁴, que juegan un importante rol en la regulación de la homeostasis cardiovascular y renal⁵, a partir de su actividad vasodilatadora, natriurética, antagonista del sistema renina angiotensina aldosterona^6-8, lusinotrópica e inhibitoria de la fibrosis miocárdica⁹. El primero en ser descubierto¹⁰ y secuenciado¹¹fue el péptido natriurético atrial (ANP). Los restantes miembros, péptido natriurético tipo B (BNP) y tipo C (CNP), fueron caracterizados en 1989¹² y en 1990¹³, respectivamente. BNP, originalmente descubierto en tejido cerebral porcino¹⁴, es sintetizado y liberado, tanto por miocitos atriales como ventriculares, sin un proceso de almacenamiento extenso^15-17. Luego de su síntesis, es liberado a la circulación como una prohormona glicosilada¹⁸ de 108 aminoácidos denominada proBNP^19,20. Esta, seguidamente, es dividida en dos fragmentos por una proteasa sérica²¹, ubicada en la membrana de los miocitos cardíacos²², la fracción carboxilo terminal no glicosilada de 32 aminoácidos, biológicamente activa, denominada C-BNP^23,24y un fragmento amino terminal no glicosilado residual²⁵ de 76 aminoácidos, inactivo, denominado NT-proBNP^26-28. BNP es liberado por el tejido cardíaco en respuesta a incrementos en el estrés parietal, primariamente a nivel ventricular²⁹. Aumentos marcados, como los que se observan en perros con insuficiencia cardíaca crónica, son provocados por el incremento de la síntesis proteica a partir de una mayor regulación génica³⁰. La síntesis y secreción de BNP se incrementa, de esta forma, en respuesta a fuerzas hemodinámicas como las que se generan a partir de la sobrecarga de volumen y/o presión que soportan las cámaras ventriculares, principalmente³¹. Los niveles circulantes de BNP se correlacionan positivamente con la severidad de la insuficiencia cardíaca³² y proporcionan un sensible biomarcador para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico de la insuficiencia cardíaca^24,33,34,35. La determinación de las concentraciones circulantes de los péptidos natriuréticos se considera parte de los análisis que se realizan para diagnosticar enfermedades cardíacas en el hombre. Teniendo presente que las patologías cardíacas crónicas representan más del 95 % de las afecciones cardiológicas en perros, no cabe duda de que los biomarcadores deben formar parte de los estudios complementarios de diagnóstico. Por esta razón, se han desarrollado pruebas caninas y felinas específicas³⁶, tanto para los fragmentos activos como residuales de los péptidos ANP³⁷ y BNP³⁸ y se encuentran disponibles comercialmente. Un hallazgo común, en las distintas investigaciones analizadas, es la variabilidad en la concentración observada, caracterizada por una amplitud de rango significativa. Los valores de corte son eficaces para distinguir entre perros sanos de pacientes asintomáticos y con signos clínicos de insuficiencia cardíaca^39-41. Sin embargo, entre los grupos A y B⁴², específicamente B1, se encuentra una proporción no menor de falsos positivos y negativos^43-46. Esta variabilidad puede obedecer a causas raciales^47-52 o, a otros factores como edad, sexo, talla, estado reproductivo, etc.^53-56. En relación con estas últimas, varios ensayos no hallaron ninguna correlación con la concentración de NT-proBNP, tanto en perros con enfermedad cardíaca como en sanos^37,38,57-63. Sí, en cambio, observaron diferencias entre caninos de raza pura y mestizos, estando, la concentración de NT-proBNP más elevada en los primeros^3,64. Otros estudios, en cambio, si hallaron diferencias en relación con edad y sexo^65,66, observando que los perros machos presentaban niveles ¼ más elevados que las hembras, al igual que los mayores de 8 años respecto a los menores de 8 años de edad^55,67-69. Por último, también se observa una amplia variabilidad individual y semanal en las concentraciones de NT-proBNP en perros sanos⁵⁸ y en aquellos perros que realizan actividad física, provocando en algunos casos elevaciones por encima del rango normal⁵². Los hallazgos descriptos podrían deberse a que en los estudios realizados se han utilizado poblaciones muy heterogéneas y de pequeño tamaño, en los grupos correspondientes a los animales sanos, las cuales pudiesen ser responsables de la variabilidad encontrada. En este marco, el objetivo fue estudiar la asociación entre la concentración de NT-proBNP y la edad, sexo y talla, en una muestra de perros sanos.

Se estudiaron 159 perros sanos, 80 machos y 79 hembras, 80 menores de 7 años y 79 mayores de 7 años, 53 de talla pequeña y peso menor de 12 kg –53 de talla mediana y peso entre 12 y 25 kg– 53 de talla grande y peso mayor de 25 kg, 107 enteros y 52 castrados. Todos los animales utilizados contaron con el consentimiento de su tutor responsable. Los perros se dividieron en 12 grupos según sexo, edad y talla. La condición corporal de cada perro se estableció, a los fines de su inclusión, entre 2.5 y 3.5, escala de 1 a 5. La selección de los animales, para establecer la condición de perro sano, se realizó a partir de un examen clínico y estudios complementarios de diagnóstico dentro de los parámetros normales (radiología de tórax, ecocardiografía convencional y Doppler, electrocardiografía, medición de presión arterial no invasiva, hemograma, bioquímica analítica y urianálisis). La determinación de la concentración de NT-proBNP se realizó mediante un Kit ELISA en sándwich canino específico (Marca USCN® Life Science Inc. –Catálogo: E90485Ca– Canis familiaris: Canine/Dog). Los valores obtenidos fueron expresados en pmol/l, unidad internacionalmente utilizada para la determinación de la concentración sérica de esta molécula, sobre la base de un peso molecular de NT-proBNP de 8.500 g/mol (8.5 KDa) y un factor de conversión de 8.5 pg/ml = 1 pmol/l (37.169). Para la realización de la técnica se siguieron estrictamente las indicaciones recomendadas por el fabricante en el manual de instrucciones y cada una de las determinaciones se realizó por duplicado. Se utilizó el suero conservado a -20 ºC durante un periodo máximo de 10 meses. El cálculo de la concentración final de cada grupo se obtuvo promediando los resultados obtenidos.Se realizó un análisis estadístico analítico, aplicando modelos de asociación, para evaluar la relación entre la concentración sérica del NT-proBNP y la edad, sexo y talla. Estos análisis se realizaron mediante un software de dominio público: R & R Commander (R cmdr) versión i386-3.0.1. La Tabla 1 muestra las características constitutivas de los 12 grupos incluidos en el ensayo.

La concentración de NT-proBNP presentó, para toda la muestra, una media 260.28 pmol/l, con una desviación estándar de ± 135.48 pmol/l y valores mínimos de 42.16 pmol/l y máximo de 603.71 pmol/l (Figura 1).

La concentración media de NT-proBNP, según sexo, para las hembras fue de 238.99 pmol/l, con una desviación estándar de ± 123.52 pmol/l y valores mínimos de 66.55 pmol/l y máximo de 587.74 pmol/l. En tanto que, para los machos, la media fue de 281.31 pmol/l, con una desviación estándar de ± 144.84 pmol/l y valores mínimos de 42.16 pmol/l y máximo de 603.71 pmol/l (Figura 2).

La concentración media de NT-proBNP, según edad, para los perros menores de 7 años fue de 235.19 pmol/l, con una desviación estándar de ± 119.72 pmol/l y valores mínimos de 72.06 pmol/l y máximo de 575.89 pmol/l. En tanto que, para los mayores de 7 años, la media fue de 285.69 pmol/l, con una desviación estándar de ± 146.97 pmol/l y valores mínimos de 42.16 pmol/l y máximo de 603.71 pmol/l (Figura 3).

La concentración media de NT-proBNP, según talla para los perros menores de 12 kg fue de 235.78 pmol/l, con una desviación estándar de ± 129.18 pmol/l y valores mínimo de 42.16 pmol/l y máximo de 587.74 pmol/l; para perros entre 12 y 25 kg la media fue de 281.85 pmol/l, con una desviación estándar de ± 134.34 pmol/l y valores mínimo de 44.83 pmol/l y máximo de 575.89 pmol/l; y para perros mayores de 25 kg la media fue de 263.21 pmol/l, con una desviación estándar de ± 142.46 pmol/l y valores mínimo de 49.81 pmol/l y máximo de 603.81 pmol/l (Figura 4).

Las concentraciones de NT-proBNP, para los 12 grupos de perros analizados, se presentan como media, desviación estándar y valores mínimos y máximos (Tabla 2). La Figura 5 permite evidenciar la distribución irregular que presentan los valores hallados en los grupos evaluados.

La concentración media para perros de raza pura fue 251.58 pmol/l, con una desviación estándar de ± 136.19 pmol/l y valores mínimo y máximo de 44.83 pmol/l y 603.71 pmol/l. En tanto que, para perros sin raza indefinida o mestizos, la media de NT-proBNP fue de 266.78 pmol/l, con una desviación estándar de ± 136.09 pmol/l y valores mínimo y máximo de 42.16 pmol/l y 575.89 pmol/l (Figura 6).

La concentración de NT-proBNP presentó diferencias estadísticamente significativas respecto a sexo (p = 0.0392) y a edad (p = 0.0124), pero no respecto a la talla del animal (p = 0.183), sobre la base de un análisis de varianza individual.El análisis de varianza para múltiples factores mostró que no se presentan diferencias estadísticamente significativas para las combinaciones sexo/edad (p = 0.107), sexo/talla (p = 0.189) y edad/sexo/talla (p = 0.765), como se observa en las Figuras 7 y 8.

El análisis realizado muestra que, además de aumentar la concentración sérica de NT-proBNP con la edad (perros mayores de 7 años presentan concentraciones séricas más altas) y el sexo (machos presentan concentraciones séricas mayores que las hembras), la concentración sérica aumenta con la edad y el incremento de la talla, analizados como variables relacionadas (p = 0.030). El análisis de varianza para los 12 grupos muestra diferencias estadísticamente muy significativas (p = 0.0062), puntualmente, entre perros machos menores de 7 años de más de 25 kg de peso y perros machos mayores de 7 años de más de 25 kg de peso (Figura 9). En contraste, entre el resto de los grupos evaluados a partir de un análisis múltiple de comparación de medias (Tukey Contrasts), no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (p > 0.05).

En el presente trabajo, la concentración de NT-proBNP fue determinada en 159 perros sanos, utilizando estrictos criterios de inclusión, con la finalidad de minimizar causas de variabilidad previas a la determinación. A pesar de estas precauciones, NT-proBNP presentó un coeficiente de variación del 52 %, de forma similar a lo observado por otros investigadores, con una muestra inferior^{35,43,48,51,58,64}. El rango más amplio se presentó en perros machos mayores de 25 kg, observándose diferencias significativas asociadas a la interacción sexo por talla.

La concentración media determinada en este estudio fue similar a las observadas por otros investigadores^{3,41,55,56,59}. Sin embargo, los valores máximos no se corresponden y se solapan, con los valores de corte establecidos por algunas marcas comercialmente disponibles. En este sentido, el 58 % de los perros sanos analizados tuvieron una concentración media de NT-proBNP superior a 210 pmol/l (valor de corte de la prueba ELISA VetSign® Canine CardioScreen, Guildhay Ltd., Biomedica, Vienna) y un 9 % presentaron un valor superior a 445 pmol/l (valor de corte de la prueba ELISA Canine specific IDEXX®). Asimismo, el valor máximo hallado en este trabajo fue similar al observado por otros investigadores^3,41, pero ligeramente inferior a otros³⁹.

La concentración de NT-proBNP presentó diferencias estadísticamente significativas asociadas a sexo y edad, de manera similar a estudios multicéntricos realizados en humanos, en muestras de 2000 y 5000 pacientes^53,54,65,66. A diferencia de estos trabajos y de otras investigaciones en perros^61,68, donde la concentración de NT-proBNP se presentó más elevada en mujeres y hembras caninas, respectivamente; en este ensayo, fueron los perros machos los que evidenciaron una concentración más alta. En ambas especies, por su parte, es la población de adultos gerontes y perros mayores de 7 años, respectivamente, los que mostraron concentraciones de NT-proBNP más elevadas que los pacientes jóvenes, al igual que en el presente estudio. A pesar de esta similitud y de observarse diferencias estadísticamente significativas, las mismas no representan la magnitud observada en pacientes humanos, en los cuales se evidencian variaciones entre 2 y 3 veces en la concentración a favor de los adultos gerontes, respecto a las poblaciones jóvenes. En este estudio solo se demostró un aumento del 30 % en la concentración, a favor de los caninos mayores de 7 años.

En investigaciones realizadas por Misbach et al. (2013), no observaron diferencias significativas asociadas a la edad⁶¹. Este hallazgo, no concordante con nuestros resultados, podría atribuirse a que los perros adultos en ese ensayo, no presentaron una edad mayor de 8 años, en comparación con una edad media de 9.75 años (rango 7.2 y 16 años), de nuestro trabajo. Esta última afirmación, muestra similitud con los resultados de Wess et al. (2011), cuando demostró que en perros Doberman Pinscher sanos la concentración de NT-proBNP incrementaba significativamente cuando superaban los 8 años⁶⁹. A pesar de estas observaciones, los resultados presentados en distintas investigaciones, tanto en el grupo control de perros sanos como de enfermos, respecto a las variables constitutivas sexo y edad, muestran resultados muy dispares^44,46. Un importante número de trabajos no observan diferencias significativas asociadas a estas variables, tanto en perros de raza pura como en animales mestizos, a pesar de observar una tendencia a presentarse más incrementada en la población de adultos gerontes^{3,37,45,57,59,60,62,63,67}. Por su parte, las diferencias estadísticamente significativas observadas en este trabajo, como en otros con hallazgos similares, se pueden corresponder con un muestreo homogéneo y al tamaño de muestra utilizado.

La talla no se asoció a variaciones en la concentración de NT-proBNP en la muestra analizada. Todos los perros incluidos presentaron una condición corporal entre 2.5 a 3.5 puntos, score que se consideró como prerrequisito. Sin embargo, esta situación puede entenderse como una limitación, ya que no permite evaluar si la concentración de NT-proBNP, en una población de perros sanos que tenga una condición corporal enmarcada en un rango más amplio, presentará variaciones estadísticamente significativas asociadas al efecto de la grasa corporal, como se ha observado en otras investigaciones^59,68.

En conclusión, podemos afirmar que la concentración de NT-proBNP en perros sanos muestra variaciones asociadas al sexo, considerándose mayor en los machos, y a la edad, encontrándose más elevada en perros mayores de 7 años. Ambas variables deben ser consideradas al realizar la interpretación de la concentración de NT-proBNP, tanto en pacientes sanos como enfermos, pero se requiere de un mayor número de trabajos para determinar los factores de ajuste a partir del uso de las distintas marcas comerciales presentes en el mercado veterinario.

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