Diagnóstico de bartonellosis en perros

El género Bartonella incluye más de 30 especies de bacterias Gram negativas intracelulares facultativas transmitidas principalmente por artrópodos hematófagos. Infectan eritrocitos y células endoteliales de diversos mamíferos.

Clínicamente, la infección por Bartonella spp. en perros puede causar bacteriemia crónica, a menudo subclínica, pero también asociarse con múltiples manifestaciones como pérdida de peso, linfoadenopatías, poliartritis, trastornos oculares, alteraciones neurológicas, y endocarditis.

El diagnóstico es complejo debido al bajo nivel de bacteriemia, la inespecificidad de los signos clínicos y la posibilidad de que perros sanos presenten bacteriemia o anticuerpos. Las principales herramientas diagnósticas incluyen cultivo bacteriano, PCR y pruebas serológicas como IFI o ELISA, aunque todas presentan limitaciones

En conclusión, la infección por Bartonella en perros representa un desafío diagnóstico y clínico, y requiere un enfoque integral que combine la información clínica, epidemiológica y de laboratorio.

El género Bartonella está compuesto por más de 30 especies y su número continúa aumentando. Son bacterias Gram negativas intracelulares facultativas que se transmiten principalmente por vectores artrópodos hematófagos e infectan eritrocitos y células endoteliales de una amplia gama de mamíferos^1,2, si bien en los últimos años se han reportado también en aves y reptiles³.

Las distintas especies de Bartonella tienen diferentes vectores, siendo plausible también la transmisión por mordedura y arañazo del hospedador, al menos en algunas especies como Bartonella henselae y Bartonella clarridgeiae^1,4,5. Las pulgas son los vectores mayormente implicados, por ejemplo Ctenocephalides felis es vector de B. henselae, B. clarridgeiae y Bartonella koehlerae^1,4,5. Entre otros vectores, Bartonella bacilliformis es transmitida por flebótomos del género Lutzomyia y Bartonella quintana por piojos del cuerpo (Pediculus humanus humanus)^1,4,5. No hay evidencia concluyente sobre el rol de las garrapatas como vectores, si bien se ha implicado a Rhipicephalus sanguineus sensu lato en la transmisión de Bartonella vinsonii subespecie berkhoffii^4,6.

Hasta la fecha, al menos 30 especies de Bartonella se han implicado en patología humana^1–3 y toda especie de Bartonella debe considerarse como potencial agente patógeno en humanos y animales^1–4. Los gatos domésticos son el principal reservorio de B. henselae y B. clarridgeiae, agentes de la enfermedad por arañazo de gato^1,4,5,7. Los perros podrían ser uno de los reservorios principales de B. vinsonii subesp. berkhoffii y Bartoella rochalimae, dado que cursan con bacteriemia prolongada por estas especies, y a su vez, los perros también pueden infectarse y enfermar por B. henselae y B. clarridgeiae, así como por otras especies como Bartonella elizabethae, Bartonella washoensis, B. koehlereae y B. quintana^3,4,7. Al igual que en los humanos, el espectro clínico de la infección por Bartonella spp. en perros está en aumento^3,4,7.

La situación epidemiológica de la infección por Bartonella spp. en perros es muy poco conocida. Los datos de seroprevalencia son muy limitados, y los reportes por métodos directos y los casos confirmados son aún más escasos^3,4.

En gran parte del mundo se ha reportado seropositividad en perros, con una amplia variación de rango, globalmente desde bajos porcentajes en países de latitudes altas a más del 30 % para países subtropicales-tropicales, así como más baja en animales sanos respecto a animales enfermos^4,7. Además se identificaron ciertos factores de riego como convivencia con bovinos, ámbito rural e infestación alta por pulgas y garrapatas ⁷. En Europa se ha reportado seropositividad variable entre 0 y 40 %, con hallazgos en Italia, Polonia, España y Reino Unido³, mientras que en EEUU se reportaron del 1.5 a 3.8 % de perros serorreactivos⁴.

Por detección directa (PCR –reacción en cadena de la polimerasa-) desde sangre los reportes son aún menores. En Europa se reportó entre 0 y 11.6 % de positividad, con hallazgos en Grecia, Italia, Polonia y España, confirmándose las especies B. henselae, B. vinsonii berkhoffii, B. rochalimae y B. koehlerae³. En EEUU se reportó 9.2 % de bacteriemia por Bartonella en perros enfermos⁴.

Esta variabilidad entre estudios (por métodos directos e indirectos) se debe a las distintas poblaciones estudiadas (animales con o sin signos, presencia de comorbilidades, hábitos de los animales, presencia de ectoparásitos, entre otras), así como a la distinta metodología utilizada.

Una vez adquirida la infección, Bartonella se ubica en los eritrocitos, pudiendo infectar también células endoteliales y células progenitoras de la médula ósea, se presenta una bacteriemia crónica, a menudo subclínica y recurrente, que puede durar semanas, meses o incluso años. La infección de las células endoteliales está relacionada con el desarrollo de trastornos como la enfermedad vasculoproliferativa y la endocarditis^1,4.

La infección por Bartonella en perros, al igual que en humanos, presenta un amplio abanico de manifestaciones clínicas: pérdida de peso, angiomatosis, peliosis hepática, linfoadenopatías, poliartritis, rinitis granulomatosa, uveítis anterior, coriorretinitis, meningoencefalitis, arritmias cardíacas, miocarditis, endocarditis, anemia, trombocitopenia, entre otras. Aunque la mayoría de las infecciones agudas por Bartonella son probablemente autolimitadas, las infecciones persistentes parecen estar asociadas con una amplia variedad de signos clínicos. La inmunosupresión predispone al desarrollo de endocarditis y otras patologías graves^3,4,7.

El diagnóstico de bartonellosis en perros representa un gran desafío, dado el amplio espectro de alteraciones patológicas. Puede ser difícil detectar Bartonella por métodos directos (cultivos o PCR ) y, a su vez, los perros sanos pueden presentar bacteriemia, con lo cual siempre debe considerarse el contexto clínico del animal junto con los antecedentes de exposición a vectores artrópodos. Se debe resaltar que considerando que la mayoría de los signos o anomalías por Bartonella son comunes a muchas otras etiologías, las pruebas diagnósticas deben incluir la evaluación de otras posibles causas. Además, la resolución de la enfermedad luego de la administración de antibióticos no necesariamente indica a Bartonella como el agente etiológico, ya que puede haber otros patógenos bacterianos sensibles a esos antibióticos, además de que la propia antibioticoterapia puede tener propiedades antiinflamatorias y/o inmunomoduladoras. En enfermedad aguda, la seroconversión puede ser de utilidad, así como la seroconversión/ serorreversión luego del tratamiento antibiótico. Los perros con endocarditis por Bartonella suelen tener altos títulos de anticuerpos, pero en esos casos difícilmente se pueda detectar por métodos directos desde sangre (cultivo y PCR). De todas formas, las tasas de seroprevalencia de Bartonella en perros no coinciden con el bajo número de casos clínicos notificados, debido por un lado a la dificultad diagnóstica que impide confirmar el caso y por el otro, a que la presencia de anticuerpos indica exposición y no necesariamente infección activa y causa de la clínica observada; adicionalmente, no se cuenta con una técnica que permita descartar la infección mediante un resultado negativo^3,4,7,8. Las anormalidades de la hematología, química y urianálisis suelen ser inespecíficas y moderadas. La anemia y la trombocitopenia se han asociado con la infección por B. vinsonii subesp. berkhoffii y B. henselae. También se ha reportado neutropenia, leucocitosis neutrofílica, eosinofilia, monocitosis, alteración de enzimas hepáticas (fosfatasa alcalina, alanina aminotransferasa) y hemoglobinuria. En el diagnóstico por imágenes se pueden observar vegetaciones valvulares compatibles con Bartonella, también se debe considerar la infección por Bartonella sp. en perros con inflamación granulomatosa de etiología indefinida o con lesiones vasoproliferativas indicativas de angiomatosis bacilar o peliosis hepática^3,4,7. En cuanto a la realización de estudios histopatológicos, existen tinciones, como la de Warthin-Starry, que permiten visualizar bacterias en muestras histológicas y posteriormente, pueden utilizarse otras técnicas tales como la inmunohistoquímica, la hibridación in situ fluorescente (FISH) y la PCR para confirmar que las bacterias observadas pertenecen al género Bartonella^3,4,7.

Las técnicas diagnósticas específicas más utilizadas para la detección de infecciones agudas y crónicas por Bartonella sp. en perros son el cultivo, la PCR, y la detección serológica de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (Tabla 1), aunque todas ellas presentan importantes limitaciones que deben ser consideradas al interpretar los resultados, tal como se mencionó previamente, la confirmación diagnóstica ha demostrado ser extremadamente desafiante, haciendo que las pruebas de diagnóstico convencionales sean relativamente insensibles en perros^3,4,7.

Las técnicas de cultivo especializadas son el estándar de oro para la confirmación de la infección por Bartonella y constan de la lisis por centrifugado, el aislamiento y el crecimiento en medios de enriquecimiento, aunque el cultivo tiene una sensibilidad especialmente baja en perros debido al bajo nivel de bacteriemia^3,4. Las muestras óptimas incluyen sangre, fluido cerebroespinal, fluido articular, efusiones patológicas y tejidos provenientes de biopsias y necropsias, y deben recolectarse de forma aséptica para evitar la contaminación con bacterias de rápido crecimiento^3,4. Las especies de Bartonella crecen en un medio especial (como agar chocolate o agar infusión cerebro-corazón enriquecido con un 5 % a un 10 % de sangre), en una atmósfera con un 5 % de CO₂, pero también pueden crecer en cultivo celular^3,4,9. Todas las especies de Bartonella crecen lentamente en agar sangre, y los aislamientos primarios aparecen después de 15 días, aunque a veces requieren 45 días para ser visibles^3,4. El aislamiento bacteriano desde muestras provenientes de la cavidad oral (saliva o hisopados orales) no resulta viable, debido a su característico lento crecimiento y a la competencia con otros microorganismos, que se desarrollan mucho más rápido¹⁰. El desarrollo de medios de enriquecimiento, tales como BAPGM (medio de crecimiento de Bartonella alpha Proteobacteria), ha permitido aumentar la sensibilidad del diagnóstico^3,4. El cultivo y subcultivo en estos medios de enriquecimiento, seguido de amplificación por PCR, mejora la detección y permite el aislamiento de la bacteria, ya que la mera detección de ADN mediante técnicas moleculares desde muestras clínicas no necesariamente indica la viabilidad del microorganismo^3,4,7. Por tratarse de una bacteria compleja en sus requerimientos y de crecimiento extremadamente lento, un cultivo de sangre o biopsia negativo no excluye la sospecha, aún luego de un largo periodo de incubación³.

Numerosas PCRs (tanto de punto final como en tiempo real) han sido desarrolladas para la detección de Bartonella^3,4,7,11. La sangre periférica es la muestra más utilizada para la detección por PCR, y al igual que en el caso del cultivo, debido a los bajos niveles de bacteriemia en los perros, la detección desde sangre suele ser sumamente difícil (a diferencia de la fácil detección de la bacteria en sangre de gatos infectados con B. henselae y B. clarridgeiae)^3,4,7. La detección molecular de Bartonella spp. pueden realizarse, además, a partir de ADN extraído de fluído cerebrospinal y articular, cultivos bacterianos, saliva, aspirado de linfonódulos y otras muestras de tejidos o aspirados. En el caso de los tejidos, y para evitar la desnaturalización del ADN es recomendable que los mismos no sean fijados en formol, utilizando tejidos frescos o congelados^3,4,7,10,11. Se ha demostrado la presencia de ADN de Bartonella en hisopados orales obtenidos de perros sin evidencia serológica de infección, un hallazgo que coincide con reportes previos en perros y humanos bacteriemicos¹⁰. Otro tipo de muestras como gotas de sangre seca (DBS, dry blood spot) han sido utilizadas para la detección molecular de patógenos a lo largo de los años, incluyendo la identificación de Bartonella en pacientes humanos. Si bien se han convertido en una herramienta valiosa en estudios médicos, y una forma práctica y sencilla para el muestreo, las aplicaciones de las DBS en la investigación veterinaria y biológica aún son limitadas^12,13. La detección molecular se realiza mediante el uso de PCR de amplio rango, que se dirigen a sitios de unión conservados flanqueando regiones del gen ARNr y el espaciador interno transcrito (ITS), o mediante el uso de genes diana específicos del organismo como gltA, rpoB, ftsZ, Pap31, ribC y groEL^3,4,7,10,11. Una combinación de varias PCR de diferentes regiones y de diferentes muestras aumenta las posibilidades de detectar el patógeno. Una vez que la PCR es positiva para el género Bartonella, las especies pueden determinarse usando cebadores especie-específicos, como se mencionó previamente, o idealmente por secuenciación de los productos amplificados^3,4,7,10,11. Se deben considerar las diferencias en la sensibilidad de las PCR utilizadas, dadas por el límite de detección o la cantidad de copias del blanco molecular en el genoma bacteriano, así como la interferencia o inhibición de la reacción, causadas, por ejemplo, por otras bacterias presentes en mayor número en la muestra seleccionada^3,4,7,10,11. Adicionalmente, el uso de PCR anidadas utilizando dos rondas sucesivas de amplificación con dos pares de cebadores diferentes, ha permitido la detección del ADN bacteriano en muestras previamente negativas, siendo importante destacar la posibilidad de la aparición de falsos positivos debidos a contaminación por el manejo de productos amplificados¹⁴. Sin embargo, es importante destacar que la detección de ADN mediante PCR no necesariamente indica la viabilidad de la bacteria. Tal como se mencionó anteriormente, el desarrollo de un enfoque de aislamiento más sensible, utilizando BAPGM seguido de PCR, ha facilitado enormemente la detección de Bartonella spp. a partir de muestras de sangre de animales enfermos o sanos^3,4,7,11.

Las pruebas serológicas utilizadas para detectar anticuerpos incluyen IFI, ELISA e inmunotransferencia (o Western blot). Actualmente, la IFI es el método de referencia para determinar la exposición a Bartonella spp., tanto con fines diagnósticos como de seroencuesta. La detección de anticuerpos contra B. vinsonii subesp. berkhoffii en un perro sospechoso de bartonelosis proporciona una sólida evidencia clínica de exposición previa y posible infección activa, y un título de 1/64 o mayor se considera de significancia. Los títulos más altos de anticuerpos contra Bartonella spp. se presentarían en perros con endocarditis y durante la fase aguda de seroconversión^3,4,7,8. Cabe destacar que existe reactividad cruzada entre las diferentes Bartonella spp. y a su vez con especies de Rickettsia. En perros con elevada infestación por garrapatas, puede haber una elevada exposición a rickettsias (con o sin infección) y ser seropositivos. En ese sentido, considerando la existencia de coinfecciones con distintos hemopatógenos (Ehrlichia spp., Babesia spp.), se deberían realizar diagnósticos específicos^3,4,7,8. Basándose en la serorreactividad en una sola muestra de suero, no es posible distinguir si los anticuerpos detectados por ELISA indican una infección aguda reciente, una infección crónica activa o una infección previa con eliminación efectiva de bacterias (exposición)⁸.

La infección por Bartonella en perros, presenta un amplio abanico de manifestaciones clínicas y un gran desafío, ya que puede ser difícil el diagnóstico tanto por métodos directos (cultivos o PCR) como indirectos (IFI, ELISA), y a su vez, perros sanos pueden presentar bacteriemia o ser seropositivos. Por lo tanto, los resultados diagnósticos deben interpretarse siempre en conjunto con el contexto clínico del animal y con los antecedentes de exposición a ectoparásitos.

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