Tarjetas FTA para la conservación y detección molecular de ácidos nucleicos: aplicación en la vigilancia del virus del Nilo Occidental

Las tarjetas FTA (Flinders Technology Associates) son matrices de papel tratadas químicamente que permiten recoger, conservar y transportar ácidos nucleicos para su posterior análisis molecular. Su formato compacto y la posibilidad de almacenar las muestras en seco han favorecido su utilización cuando el procesamiento inmediato o el mantenimiento continuo de la cadena de frío resultan difíciles. El objetivo de este trabajo es describir el fundamento, las aplicaciones, ventajas y limitaciones de las tarjetas FTA, con especial atención a su empleo en la vigilancia entomológica de arbovirus y, concretamente, del virus del Nilo Occidental (VNO), así como presentar su aplicación práctica dentro del proyecto “VECTOR-EX”.

La evidencia disponible muestra que las tarjetas FTA pueden conservar ADN y ARN y facilitar el procesamiento de muestras destinadas a PCR, RT-PCR o RT-qPCR, aunque su rendimiento depende del agente, del tipo de muestra y de las condiciones de conservación y extracción. En programas de vigilancia de enfermedades vectoriales, su incorporación a trampas de mosquitos permite detectar material viral depositado con la saliva durante su alimentación y reducir parte del procesamiento asociado al análisis de grandes cantidades de ejemplares. Estudios realizados en distintos países han demostrado su aplicación para la detección del VNO en condiciones de campo.

Actualmente, esta metodología se está evaluando en Extremadura dentro del proyecto VECTOR-EX como herramienta complementaria para la vigilancia del VNO, aunque todavía son necesarios resultados definitivos que permitan establecer su rendimiento frente al análisis directo de los mosquitos.

Las técnicas de diagnóstico molecular basadas en la detección de ADN o ARN dependen de la calidad y cantidad del ácido nucleico disponible en el momento del análisis. En particular, el rendimiento de técnicas como la RT-qPCR puede verse condicionado por lo ocurrido con la muestra antes de su procesamiento, por lo que la fase preanalítica forma parte del procedimiento diagnóstico¹. La integridad del material genético debe preservarse desde la recogida, durante el acondicionamiento y transporte, y hasta su procesamiento y extracción en el laboratorio. Estas etapas son especialmente importantes cuando se trabaja con ARN, ya que las condiciones de manipulación y conservación pueden afectar a su estabilidad y, por tanto, a la cantidad de secuencia diana disponible para la amplificación². Una conservación adecuada es, por ello, necesaria para obtener resultados moleculares fiables y reproducibles.

Actualmente, la refrigeración o congelación inmediata sigue siendo una estrategia de referencia para preservar ARN en muestras diagnósticas². Sin embargo, mantener una cadena de frío continua desde el punto de muestreo hasta el laboratorio exige equipos, suministro energético, espacio de almacenamiento y una logística adecuada. Estas limitaciones pueden cobrar especial importancia en trabajos de campo o en localizaciones alejadas. En la vigilancia entomológica, estas dificultades se acentúan cuando deben recogerse y procesarse grandes cantidades de mosquitos: el transporte y almacenamiento requieren conservar la integridad del material viral y el cribado convencional implica además identificación, clasificación y procesamiento de numerosos ejemplares.

Estas limitaciones han favorecido el desarrollo de sistemas alternativos de conservación, entre ellos las tarjetas FTA, concebidas como soportes sólidos para la recogida y preservación de ácidos nucleicos. Su interés radica en la posibilidad de estabilizar el material genético sobre un soporte compacto y fácilmente transportable, reduciendo determinadas exigencias asociadas al almacenamiento y transporte convencional. En la bibliografía consultada sobre la vigilancia de arbovirosis (enfermedades víricas transmitidas por vectores artrópodos), distintos trabajos explican el uso de estas tarjetas para conservar material destinado al análisis molecular y han destacado su utilidad cuando la cadena de frío o el procesamiento inmediato de las muestras resultan difíciles³. Por ello, las FTA constituyen una alternativa de interés para diagnóstico, investigación y vigilancia, aunque su fundamento, funcionamiento y limitaciones requieren una consideración específica en los apartados siguientes.

Como ya se ha comentado, las tarjetas FTA son soportes de papel de filtro diseñados para recoger y conservar ácidos nucleicos procedentes de material biológico. Su empleo se introdujo inicialmente para la conservación de muestras de sangre destinadas a aplicaciones forenses, y posteriormente se extendió al análisis genético de microorganismos, plantas y muestras clínicas⁴. En la actualidad existen diferentes formatos de tarjetas FTA, adaptados a distintos volúmenes y tipos de muestra. Estas variantes pueden diferir en el tamaño, la superficie disponible para la aplicación de la muestra o en características específicas destinadas a facilitar su visualización, conservación o posterior recuperación de los ácidos nucleicos.

A grandes rasgos, las tarjetas FTA están formadas por una matriz de papel tratada químicamente. Al entrar en contacto con la muestra, sus componentes favorecen la lisis celular, la desnaturalización de proteínas y la estabilización de los ácidos nucleicos, que quedan retenidos en la matriz para su posterior análisis. Finalmente, una porción de la tarjeta puede procesarse mediante lavado, elución o extracción para recuperar el material genético y utilizarlo en técnicas moleculares como PCR o qPCR^4,5.

Las tarjetas FTA suelen almacenarse secas, en sobres sellados y preferiblemente acompañadas de un agente desecante que contribuya a mantener unas condiciones de baja humedad durante el transporte y el almacenamiento. En cuanto a su capacidad de conservación de ADN y ARN, se ha demostrado que, en muestras de sangre, el ADN puede mantenerse en condiciones adecuadas para su amplificación por PCR durante periodos de semanas hasta el año. En estudios realizados con tarjetas FTA tipo “Classic” y “Elute”, no se observaron diferencias significativas en la cantidad de ADN recuperado tras periodos de almacenamiento de entre una semana y un año, a temperaturas comprendidas entre la temperatura ambiente y −80 °C⁶.

No obstante, durante almacenamientos prolongados se podría observar una disminución de la cantidad de ADN recuperado y signos de degradación en fragmentos de mayor tamaño⁷, por lo que la posibilidad de amplificar una secuencia no implica necesariamente la conservación íntegra del material genético.

Si nos centramos en la conservación de ARN, debemos tener en cuenta que, debido a su mayor labilidad y susceptibilidad a factores externos, las condiciones de almacenamiento adquieren especial importancia. La evidencia disponible muestra que las tarjetas FTA pueden mantener ARN amplificable durante periodos prolongados, incluso a temperatura ambiente, aunque la estabilidad aumenta generalmente cuando se emplean temperaturas más bajas y condiciones de desecación. En el caso del ARN viral, los estudios revisados han empleado periodos de almacenamiento de hasta varios meses y temperaturas comprendidas entre −20 °C y 37 °C, lo que refleja una considerable variabilidad entre protocolos^4,5.

Debido a su naturaleza absorbente, la tarjeta FTA permite trabajar con una amplia variedad de muestras biológicas. Se han utilizado con sangre, suero, plasma, suspensiones celulares, tejidos e improntas de tejido, esputo, frotis cervicales e hisopos bucales, entre otras matrices⁴. En el ámbito veterinario también se han empleado con hisopos cloacales y orofaríngeos, improntas pulmonares y fluidos orales, mientras que los estudios sobre ARN viral incluyen asimismo líquido alantoideo y muestras fecales^2,5. Su aplicación se extiende, además, al material procedente de artrópodos, como la saliva de mosquitos depositada sobre la tarjeta durante la alimentación del insecto de los azúcares añadidos a la tarjeta³.

Toda esta variedad de matrices muestra la versatilidad de la tecnología FTA para diferentes aplicaciones diagnósticas y de investigación.

Entre las principales ventajas de las tarjetas FTA destaca su simplicidad logística. Son soportes pequeños, ligeros y fáciles de almacenar y transportar, por lo que reducen el volumen de material que debe manejarse y pueden facilitar el envío de muestras a laboratorios de referencia. Además, en determinadas aplicaciones, permiten disminuir la dependencia de sistemas de refrigeración durante el transporte y reducir los recursos necesarios para el almacenamiento de muestras. Esto puede resultar especialmente útil cuando no se dispone temporalmente de infraestructuras como congeladores de −80 °C, ya que las tarjetas pueden ofrecer una alternativa para conservar el material genético durante un periodo limitado hasta que sea posible su procesamiento o su traslado a instalaciones adecuadas. En cualquier caso, esta posibilidad depende del tipo de ácido nucleico, del agente y de las condiciones de almacenamiento, por lo que no debe interpretarse como una sustitución universal de la ultracongelación.

Las FTA también pueden aportar una ventaja en bioseguridad, ya que su matriz química es capaz de inactivar determinados agentes infecciosos. En ensayos con arbovirus, se demostró la inactivación de virus Sindbis, Chikungunya y de la Encefalitis japonesa tras su aplicación sobre tarjetas FTA Classic. Esta característica puede simplificar la manipulación y el transporte de determinadas muestras, aunque debe validarse para cada agente⁸.

Otra ventaja de las tarjetas FTA es que pueden reducir la carga de trabajo asociada al procesamiento de grandes cantidades de muestras. Su utilización permite simplificar algunas etapas previas al análisis molecular y concentrar los análisis posteriores en aquellas muestras que resulten de mayor interés. Esta característica puede resultar especialmente útil en programas de vigilancia con un elevado número de muestras.

Otro aspecto favorable de las tarjetas FTA es que no es necesario procesar toda la superficie impregnada en un único análisis. El procedimiento habitual consiste en recortar uno o varios discos de la zona que contiene la muestra y utilizar únicamente esos fragmentos para la extracción del ácido nucleico, de modo que el resto de la tarjeta puede conservarse para posibles análisis posteriores, siempre que la cantidad y distribución de la muestra depositada sean suficientes y se mantengan unas condiciones adecuadas de almacenamiento.

En cuanto a las limitaciones, una de las principales es que la recuperación de ADN o ARN a partir de las tarjetas FTA puede presentar una sensibilidad inferior a la obtenida mediante extracción directa, especialmente cuando la cantidad inicial de material genético es baja. Además, la conservación del ARN no es uniforme, ya que su estabilidad puede verse afectada por el tiempo y la temperatura de almacenamiento y puede variar entre distintos virus, incluso cuando se mantienen condiciones similares. Una degradación progresiva del ARN o una recuperación insuficiente pueden disminuir la cantidad de material disponible para el análisis y aumentar el riesgo de resultados falsamente negativos, por lo que las condiciones de conservación y el procedimiento de extracción deben validarse para cada aplicación concreta.

También debe tenerse en cuenta que la inactivación viral no está garantizada en todos los casos. La evidencia disponible es todavía limitada, ya que solo una parte de los estudios ha evaluado específicamente este aspecto y se ha descrito al menos un caso en el que el virus permaneció infectivo. Por ello, la bioseguridad debe comprobarse de forma específica para cada agente y para cada protocolo utilizado⁵ (Tabla 1).

El uso de tarjetas FTA en vigilancia entomológica se basa en aprovechar el comportamiento de alimentación de azúcares que necesitan los mosquitos. Cuando un mosquito infectado se alimenta sobre una fuente de azúcar, puede expulsar, junto con la saliva, partículas virales o material viral, que quedan depositados sobre el sustrato utilizado durante la alimentación.

Las tarjetas FTA se colocan en el interior de la trampa de captura, de forma que los mosquitos tengan acceso a su superficie durante el periodo de permanencia en la trampa (Figura 1 A,B). Habitualmente se emplea miel o una solución azucarada para favorecer la alimentación, de manera que la tarjeta actúa al mismo tiempo como fuente de alimento y como soporte sobre el que puede quedar depositada la saliva. En algunos protocolos se mezcla la solución azucarada con un colorante (Figura 1 C) para comprobar posteriormente si los mosquitos han ingerido dicha solución^3,10,11.

Una vez finalizado el periodo de captura, la tarjeta se procesa para recuperar el material viral depositado durante la alimentación. Según el protocolo, puede utilizarse una porción o la tarjeta completa para la extracción del ARN, que posteriormente se analiza mediante técnicas moleculares como RT-PCR o RT-qPCR. En algunos estudios, los resultados positivos se han confirmado mediante técnicas adicionales, como PCR hemi-nested y secuenciación^3,11.

El uso de tarjetas FTA para la vigilancia de enfermedades transmitidas por mosquitos permite la reducción del procesamiento asociado a la vigilancia convencional mediante el análisis directo de los insectos. El análisis tradicional requiere recuperar los ejemplares, clasificarlos, agruparlos y realizar extracciones de ARN y análisis moleculares sobre numerosos pools, además de mantener condiciones adecuadas de conservación durante su transporte y almacenamiento. El empleo de tarjetas FTA permite, cuando el objetivo principal es determinar si existe circulación viral en un punto de muestreo, analizar directamente el material depositado sobre la tarjeta sin necesidad de procesar individualmente todos los mosquitos capturados, reduciendo así la carga de trabajo de campo y laboratorio y la dependencia de una cadena de frío estricta.

Esta característica puede resultar especialmente útil en programas cuyo objetivo sea realizar un cribado inicial de circulación viral, ya que puede reducir la necesidad de identificar taxonómicamente y analizar de forma sistemática grandes cantidades de mosquitos. De hecho, se ha planteado que estos sistemas podrían llegar a evitar la recogida e identificación masiva de ejemplares cuando únicamente se pretende detectar la presencia del virus en una zona determinada.

Sin embargo, esta simplificación supone una pérdida de información entomológica. Una tarjeta positiva permite demostrar la presencia de material viral en los mosquitos que han interactuado con ella, pero, si los ejemplares capturados no se identifican y analizan paralelamente, no permite determinar qué especie estaba infectada. Por tanto, cuando se necesita conocer la especie vectora implicada, la FTA debe complementarse con la identificación y el análisis de los mosquitos capturados.

Sin embargo, la principal limitación es su menor sensibilidad respecto al análisis directo de pools de mosquitos. Para que el virus sea detectado en la tarjeta, el mosquito infectado debe haber desarrollado una infección capaz de alcanzar las glándulas salivales y, además, debe depositar saliva sobre la FTA durante su permanencia en la trampa. En ensayos de campo, no todos los mosquitos capturados se alimentaron sobre las tarjetas y el sistema FTA dejó sin detectar virus presentes en algunos pools positivos¹¹; por ello, en ocasiones una tarjeta negativa no permite descartar la existencia de circulación viral en el punto de muestreo.

El VNO es una arbovirosis zoonótica de importancia médica y veterinaria, cuyo ciclo se mantiene principalmente entre mosquitos del género Culex y aves silvestres, mientras que humanos y équidos actúan como hospedadores accidentales¹².

Su circulación puede mantenerse de forma silenciosa antes de la aparición de casos clínicos humanos, por lo que la vigilancia entomológica resulta especialmente útil para detectar actividad viral de forma precoz y delimitar zonas de riesgo¹³. En este contexto, las tarjetas FTA pueden ser una alternativa útil y emplearse como herramienta complementaria para la detección molecular del VNO en programas de vigilancia vectorial.

La aplicación de tarjetas FTA para la vigilancia del VNO se ha evaluado en distintos escenarios. En Alemania, su incorporación permitió detectar ARN de VNO y virus Usutu durante un episodio de circulación activa en un zoológico¹⁴. En Italia, también el uso de una trampa BG-Sentinel modificada con tarjeta FTA permitió identificar circulación de VNO y virus Usutu en campo¹¹. También se ha empleado esta estrategia en programas de vigilancia del VNO en Australia, donde el análisis de las tarjetas FTA mostró resultados concordantes, en términos generales, con otros sistemas de vigilancia empleados de forma paralela¹⁵.

En Extremadura, el uso de trampas BG-Sentinel modificadas con tarjetas FTA se está evaluando dentro del proyecto de investigación VECTOR-EX, desarrollado en zonas de las Vegas Altas del Guadiana con antecedentes de circulación del VNO y elevada presencia de mosquitos competentes para la transmisión de este virus. El objetivo es incorporar esta metodología como herramienta complementaria a la vigilancia entomológica convencional y valorar su utilidad para la detección temprana de circulación viral.

El área de estudio comprende diez localidades de las Vegas Altas del Guadiana, donde se realiza vigilancia entomológica periódica mediante diferentes sistemas de captura. En estos puntos se emplean principalmente trampas tipo BG-Sentinel y CDC, manteniendo un esquema de muestreo estandarizado que permite realizar un seguimiento espacial y temporal de las poblaciones de mosquitos a lo largo del periodo de actividad vectorial. Dentro de este sistema de vigilancia, se decidió incorporar como método novedoso las tarjetas FTA con el objetivo de evaluar una metodología de detección pasiva que pudiera complementar el análisis molecular convencional de los mosquitos capturados.

La metodología empleada se basa en el sistema desarrollado por Manzi et al. (2023), aunque con algunas modificaciones para adaptarlo a las condiciones del proyecto y del área de estudio. Se utiliza una trampa BG-Sentinel como capturador de los mosquitos a la que se le incorpora CO₂ (hielo seco) como atrayente, y cuya liberación progresiva favorece la atracción de los mosquitos. A esta trampa se le incorpora un soporte donde se encuentra la tarjeta FTA, de manera que los mosquitos entran en dicho soporte y allí permanecen vivos durante el periodo de muestreo alimentándose sobre la tarjeta impregnada en una solución de agua y miel, posibilitando la regurgitación de saliva y, en caso de infección, de material viral sobre la tarjeta. Las tarjetas también se impregnan con azul de metileno, con el fin de reconocer con posterioridad aquellos mosquitos que se han alimentado, pues adquieren una coloración azulada en su abdomen (Figura 2).

Actualmente se están evaluando distintos tiempos de permanencia de los mosquitos en contacto con la tarjeta FTA. Esto permitirá determinar, en condiciones de campo, cuál es el tiempo idóneo de permanencia de los mosquitos vivos alimentándose sobre la tarjeta FTA en el soporte de la trampa para aplicarlo en programas de vigilancia del VNO en Extremadura.

Por tanto, la metodología que se está desarrollando dentro del proyecto VECTOR-EX debe entenderse como una evaluación metodológica destinada a determinar la utilidad futura de las FTA como herramienta complementaria para la vigilancia entomológica del VNO.

Las tarjetas FTA constituyen una herramienta eficaz para la conservación y detección molecular de ácidos nucleicos virales, tanto en muestras biológicas como en sistemas de vigilancia entomológica. Su principal interés se encuentra en aquellas situaciones en las que el procesamiento inmediato de las muestras o el mantenimiento continuado de la cadena de frío resultan difíciles, ya que permiten simplificar determinadas etapas de conservación, transporte y procesamiento.

Su incorporación a los protocolos diagnósticos requiere, sin embargo, una puesta a punto específica para cada aplicación. El rendimiento depende del virus, de la cantidad inicial de material genético, de las condiciones de almacenamiento y del procedimiento empleado para recuperar los ácidos nucleicos. La optimización de aspectos como la cantidad de tarjeta procesada, el método de extracción, la temperatura y el tiempo de conservación resulta fundamental para maximizar la sensibilidad y reducir al mínimo la posibilidad de resultados falsamente negativos. Del mismo modo, la capacidad de inactivación viral debe comprobarse para cada agente antes de asumir que el procesamiento sobre FTA garantiza por sí mismo condiciones adecuadas de bioseguridad.

En vigilancia de arbovirus, las tarjetas FTA constituyen una herramienta complementaria para detectar circulación viral a partir del material depositado por los mosquitos durante la alimentación azucarada. Su utilización reduce la necesidad de procesar de forma sistemática grandes cantidades de ejemplares y puede facilitar la ampliación espacial o temporal de los programas de vigilancia. No obstante, su rendimiento está condicionado por la interacción del mosquito con la tarjeta y por la presencia de virus en la saliva, por lo que una tarjeta negativa no permite descartar por sí sola la circulación viral. Por este motivo, su mayor utilidad se encuentra en su integración con los sistemas convencionales de vigilancia, y no en su sustitución completa.

En el caso del VNO, la evidencia disponible respalda el uso de esta estrategia como una opción viable para complementar la vigilancia entomológica. La estandarización de las condiciones de captura, alimentación, tiempo de exposición, conservación y procesamiento de las tarjetas, así como la comparación de su sensibilidad frente al análisis convencional de pools de mosquitos, constituyen aspectos clave para definir su aplicación práctica. En este contexto, la evaluación desarrollada en VECTOR-EX permite avanzar en la validación del sistema y determinar su utilidad como herramienta complementaria para la vigilancia del VNO en Extremadura.

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