Técnicas e interpretación de muestreo traqueobronquial

El manejo de las afecciones respiratorias en caninos y felinos constituye un campo en constante progreso que ha experimentado avances significativos gracias a la mayor accesibilidad a técnicas diagnósticas avanzadas en los centros veterinarios, así como el mejor conocimiento de las técnicas anestésicas que permiten realizar procedimientos diagnósticos y terapéuticos con mayor seguridad y eficacia. Entre estas técnicas, la broncoscopia destaca por permitir una visualización directa de las vías respiratorias y la toma de muestras para análisis, lo que facilita, en numerosas ocasiones, la gestión de nuestros casos.

La técnica de recolección de muestras respiratorias es un procedimiento que contribuye al diagnóstico de diversidad de trastornos pulmonares. Mediante técnicas como el lavado traqueobronquial (LTB), el cepillado bronquial (CB) o el lavado broncoalveolar (LBA), es posible obtener muestras representativas de la tráquea y los bronquios mayores. Estas muestras pueden ser de mucha ayuda para el diagnóstico de patologías respiratorias en las cuales sus características clínicas y radiográficas no permiten determinar la etiología subyacente de manera clara. El análisis citológico de estas muestras permite poner en evidencia la presencia de agentes infecciosos, células inflamatorias y otros marcadores de enfermedad, lo cual es esencial para la elección de un tratamiento apropiado.

Las muestras pueden ser tomadas mediante varios métodos, incluyendo lavado traqueobronquial (transtraqueal o endotraqueal) (LTB), cepillado bronquial (CB) o lavado broncoalveolar (LBA) (Tabla 1).

Los lavados transtraqueales y endotraqueales son procedimientos mínimamente invasivos que permiten obtener muestras a ciegas de las vías respiratorias mayores para análisis citológicos y cultivo. Las muestras de LTB recogen células exfoliadas de la superficie de las vías respiratorias más grandes y no reflejan la misma población de células que los LBA. No hay selectividad en la recolección de muestras, ya que el líquido se recupera de manera no específica con esta técnica^1–4.

El lavado transtraqueal, también conocido como técnica percutánea, se realiza introduciendo, de manera aséptica, una aguja de calibre grueso (18 G o 16 G) a través del ligamento cricotiroideo, justo debajo de la laringe (en perros de gran tamaño se puede penetrar entre dos anillos traqueales). Una vez en la luz traqueal, se introducirá a través de la aguja un catéter urinario estéril (o sonda de alimentación) hasta un nivel justo por encima de la carina para instilar la solución salina fisiológica (1-2 ml por cada 5 kg de peso corporal) (Figura 1), Lo normal es que el paciente comience a toser antes de que todo el suero sea inyectado, momento en el que aspiraremos de nuevo para obtener la muestra^3,4.

Se realiza una intubación con un tubo endotraqueal estéril evitando en la medida de los posible el contacto con la mucosa orofaríngea. Con el paciente en decúbito esternal o lateral (con el lado más afectado hacia la mesa) se introduce un catéter estéril a través del tubo endotraqueal, haciéndolo avanzar hasta notar una pequeña resistencia. Se retira entonces unos 3 mm, reintroduciéndolo de nuevo hasta el lugar de resistencia, y se instila la solución salina (2-5 ml/kg) y de inmediato se procede a su aspiración³ (Figura 2).

Los cepillados bronquiales se realizan generalmente a través de un broncoscopio bajo visualización directa (Figura 3), obteniendo células de un área focal y tendiendo a muestrear más profundamente en la mucosa queun simple lavado de la superficie. Su indicación primordial es para la evaluación de lesiones bronquiales focales

El cepillo está cubierto por una funda de plástico retráctil. Con la punta del broncoscopio en la ubicación deseada, este pequeño cepillo se pasa a través del canal de muestreo. Una vez que se visualiza el catéter, se retrae la funda y el cepillo se frota suavemente contra la mucosa (con movimientos de rotación y avance-retroceso). Luego, el cepillo se retrae de nuevo en vaina protectora y se retira del broncoscopio. El cepillo se puede frotar suavemente en un portaobjetos para el examen citológico y/o introducir en un medio para su cultivo y antibiograma^2,3,5,6 (Figura 4).

Este procedimiento es muy seguro y rápido, e identifica células que no exfolian en el líquido de LBA⁷. También es una excelente manera de evaluar el epitelio bronquial.

El lavado broncoalveolar se efectúa insertando el broncoscopio en una vía respiratoria distal, lo que permite evaluar enfermedades pulmonares que inciden en las pequeñas vías, alvéolos y en el tejido intersticial^3,4.

El procedimiento se lleva a cabo a través del tubo endotraqueal con un adaptador en T^4,5, pero en pacientes pequeños, el diámetro interno del tubo puede limitar la intervención, haciendo necesaria la inserción directa del broncoscopio (Figura 5). En estos casos, es ventajoso introducir un catéter estéril de pequeño calibre junto al broncoscopio para suministrar oxígeno suplementario². El LBA se realiza tras la exploración visual y antes de procedimientos más invasivos como biopsias o cepillados, que podrían causar sangrado y alterar los resultados del lavado^5,8.

Una vez que se completa la evaluación visual inicial de las vías respiratorias inferiores^5,6,9 (Figura 6) (Tabla 2), se retira el endoscopio del paciente y se limpia el canal del endoscopia, alternando la succión con solución salina estéril y aire inmediatamente antes de realizar el LBA. Este procedimiento, asumiendo una esterilización adecuada del endoscopio antes de su uso, permite la recolección de muestras para citología y cultivo sin contaminación de las vías respiratorias superiores^6,10.

El broncoscopio se orienta hacia el bronquio seleccionado y se avanza hasta que se ajusta o bloquea la vía respiratoria. Manteniendo el lumen bronquial en el centro de la imagen, se introduce en forma de embolada solución salina estéril al 0.9 % a través del canal de trabajo, seguida por la instilación de una cantidad de aire suficiente que asegure el vaciado de todo el canal de succión. Alternativamente, el procedimiento se puede realizar utilizando un catéter de lavado que se pasa a través del canal de biopsia hacia las vías respiratorias más profundas y pequeñas⁵. La aspiración del líquido introducido se puede realizar manualmente con la jeringa, o utilizando un aspirador con una presión de succión, evitando una excesiva presión negativa que podría ocasionar el colapso de la vía aérea distal impidiendo la recuperación del líquido del lavado (Figura 7). Se ha visto que el porcentaje de líquido de lavado broncoalveolar recuperado es significativamente mayor cuando se utiliza una bomba de succión, aunque este factor no parece tener efecto sobre la tasa de diagnóstico definitivo alcanzado¹¹.

El LBA se puede realizar en cualquier territorio pulmonar. En pacientes con patología pulmonar localizada debe efectuarse en el segmento o lóbulo más afectado o de previsible mayor rendimiento (zona identificada en las pruebas de imagen previas). Cuando se trata de una enfermedad difusa cualquier zona podría ser idónea para realizar este estudio, pero de preferencia debería hacerse en dos localizaciones, recomendándose el lóbulo medio derecho y la porción caudal del lóbulo craneal izquierdo^6,12,13. Asimismo se recomienda efectuar al menos dos lavados en cada localización, dado que el análisis del segundo lavado suele proporcionar un diagnóstico más preciso de enfermedades pulmonares, tanto inflamatorias como no inflamatorias y la primera alícuota suele mostrar mayor número de células epiteliales ciliadas en comparación con los muestreos subsiguientes^6,14.

No existe acuerdo acerca de la cantidad de líquido o del número idóneo de alícuotas necesarias que permitan obtener datos significativos. La dosis de solución salina se determina según el tamaño del paciente, con recomendaciones que oscilan entre 5-30 ml por alícuota o de 2-5 ml/kg². En un estudio en perros, se utilizó un volumen total de 15 a 75 ml por perro, dividido en dos o más alícuotas⁷. En un estudio de 68 gatos¹⁵, el volumen medio de líquido infundido fue entre 2.62 y 5.05 ml/kg, en alícuotas de 5-10 ml por sitio. Como recomendación general podemos utilizar un volumen por alícuota de 10-20 ml para perros y ~2 ml/kg para gatos⁶. El LBA puede ser considerado técnicamente aceptable si el líquido recuperado es igual o superior al 40 % del instilado y contiene escasas células epiteliales².

El procedimiento no está exento de complicaciones, aunque en baja frecuencia. Entre las complicaciones potenciales del lavado broncoalveolar se encuentran la disminución de la saturación de oxígeno, el broncoespasmo y el neumotórax. Se aconseja suministrar oxígeno al 100 % tanto antes como tras la finalización de LBA. El broncoespasmo como complicación de la broncoscopia y el LBA se observa más comúnmente en gatos y la premedicación con un broncodilatador puede reducir esta complicación^13,15,16 (Figura 8).

El líquido obtenido es ligeramente turbio, dependiendo de la cantidad de material celular y no celular en suspensión, y con una capa espumosa en la parte superior, representativa del surfactante⁵. Un aumento en la turbidez y el cambio de color suelen estar asociados con cantidades incrementadas de mucosidad y/o células (Figura 9). Si la muestra adquiere tintes rojizos, es probable que exista algún grado de hemorragia espontánea o inducida por el procedimiento.

El líquido obtenido puede evaluarse citológica y microbiológicamente. Las muestras para cultivo pueden enviarse en un tubo estéril o en hisopo con medio de cultivo, mientras que para su estudio citológico las muestras deben conservarse en EDTA. El análisis de la primera alícuota suele mostrar mayor número de células epiteliales ciliadas en comparación con los muestreos subsiguientes¹⁴. Por este motivo, es frecuente destinar esta primera alícuota a cultivos microbiológicos, mientras que todas las restantes, se procesan mezcladas en un solo pool.

La muestra debe procesarse de inmediato, el LBA no debe almacenarse durante más de 8 horas o a altas temperaturas, ya que estos factores se asocian con una reducción significativa de los recuentos de células totales y la calidad de la morfología celular (Figura 10). Se recomienda, sea para revisión en el propio centro o para su envío a laboratorio externo, preparar algunos frotis directos o con técnicas de concentración en los 30 minutos siguientes a la obtención de la muestra⁴. Para obtener los mejores resultados, se recomienda el uso de una citocentrífuga³, pero otra opción, al alcance de todos, es utilizar el sedimento tras centrifugación a 500-1000 rpm durante 5 minutos o emplear métodos de concentración caseros (Figura 11). En gatos se ha visto que el almacenamiento puede provocar alteración del diagnóstico citológico en un rango del 31 al 57 % de las muestras y la morfología celular experimenta una modificación significativa en todas las muestras almacenadas. Es por esto que en caso de que no sea posible evitar un retraso en el análisis, se prefiere el almacenamiento a 4 °C en lugar de a temperatura ambiente¹⁷.

Los procedimientos citológicos de aplicación clínica habitual incluyen el recuento diferencial de los diferentes tipos celulares presentes y la visualización de agentes infecciosos.

El recuento total de células nucleadas no se informa debido a que es probable que sea inexacto, tanto con métodos manuales como automatizados, a causa del moco que provoca la aglutinación de las células (Figura 12), dificultando o imposibilitando su conteo⁴. Además, otro factor confusor y causante de variabilidad es el hecho de que el recuento celular depende en gran medida de la técnica de muestreo utilizada para recolectar la muestra (cantidad de líquido instilado, el número de alícuotas, método de recuperación, técnica de concentración).

El recuento diferencial de células nucleadas es más relevante tanto para fines diagnósticos como clínicos y se basa en contar al menos 200 células, aunque idealmente se sugieren 500 células¹⁸. Solo se consideran los leucocitos, las células epiteliales se excluyen y se evalúan por separado de manera semicuantitativa (ausentes, pocas, cantidad pequeña/moderada/alta).

Existen factores que pueden afectar el recuento diferencial de células nucleadas. Estos están relacionados con el tipo de muestra y sus técnicas de recolección:

• La alícuota de muestra analizada: la primera alícuota suele contener más neutrófilos.
• Tipo de preparación citológica: las muestras de citocentrifugado contienen menos linfocitos.
• Retraso en la preparación de la muestra: los neutrófilos y eosinófilos parecen disminuir en muestras envejecidas.
• Edad del paciente: los perros más jóvenes tienen significativamente más neutrófilos que los perros de mediana edad y viejos, así como más linfocitos que los perros de mediana edad⁹.

En la evaluación citológica del tracto respiratorio y el parénquima pulmonar, se identifica una variedad limitada de tipos celulares, entre los que destacan: macrófagos alveolares, neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, mastocitos, eritrocitos y epitelio bronquial provisto de cilios. Adicionalmente, es posible hallar células plasmáticas, epitelio escamoso y células caliciformes en determinadas muestras. Asimismo, se puede detectar señales de contaminación oral, como la presencia de Conchiformibius spp y epitelio escamoso colonizado por una diversidad de bacterias, lo cual puede alterar la interpretación de la muestra¹⁹ (Figura 13).

Cada técnica de muestreo presenta variabilidad en la composición de la muestra y, debido a que las células obtenidas provienen de distintas partes de las vías respiratorias, cada método requiere criterios de evaluación específicos que reflejan las diferencias esperadas entre estos procedimientos¹.

• Las muestras obtenidas de las vías aéreas superiores, como el lavado traqueobronquial, reflejan predominantemente la presencia de epitelio columnar ciliado, característico de estas grandes vías (Figura 14). Por lo tanto, es habitual encontrar en el LTB una mayor cantidad de estas células en comparación con las muestras de LBA. Durante la preparación de las muestras, si las células sufren algún tipo de traumatismo, pueden presentar daños y perder sus cilios, los cuales pueden observarse dispersos en el fondo y ser confundidos con bacterias. Además, es común que las muestras de LTB contengan una cantidad significativa de residuos y moco.

• En la citología obtenida mediante cepillado, las células principales son el epitelio columnar ciliado, que se organiza en hileras o agrupaciones de tres a cuatro células. En ocasiones es posible ver células inflamatorias, células caliciformes y algún mastocito. En estas preparaciones, generalmente no se identifican macrófagos alveolares, ya que esta técnica no recupera células de las vías respiratorias inferiores (Figura 15). Una ventaja de este método es que puede permitir la identificación de células inflamatorias que se encuentran únicamente dentro de la mucosa de las vías respiratorias o adheridas al epitelio de las vías respiratorias. En este sentido un estudio mostró que la mayoría de los perros con tos que no tenían inflamación neutrofílica en el LBA tenían inflamación neutrofílica en los cepillados bronquiales. Por lo tanto, parece que la evaluación citológica de los CB pudiera ser un indicador más sensible de inflamación bronquial que la evaluación citológica del líquido de LBA⁷.

• Los LBA caninos normales contienen mayoritariamente macrófagos alveolares (Figura 16) con escasos neutrófilos, eosinófilos y mastocitos. En comparación con las muestras caninas, es habitual que las muestras felinas normales presenten una cantidad significativamente mayor de eosinófilos. Los eritrocitos y las células epiteliales deben encontrarse en números muy bajos, especialmente si la broncoscopia fue atraumática. Las células caliciformes y las espirales de Curschmann son raramente observadas, mientras que el moco puede aparecer como material amorfo de coloración variable. También es posible hallar artefactos como gránulos de almidón, generalmente derivados del polvo de los guantes utilizados en el procedimiento. Por su parte un excesivo número de células ciliadas o escamosas epiteliales son indicativos de contaminación por el material bronquial u oral, lo que indica que el espécimen puede no ser representativo de las porciones más profundas.

El cultivo o reacción en cadena de la polimerasa para agentes infecciosos pueden utilizarse para caracterizar mejor una infección observada en la citología o para investigar la posibilidad de una infección bacteriana, viral o fúngica cuando se observa un aumento en el número de células inflamatorias en la citología, pero no se detectan microorganismos^19,20.

Hay disponibles otras pruebas complementarias de diagnóstico en función del agente infeccioso. Por ejemplo, el diagnóstico de Angiostrongylus vasorum, en perros, o Aelurostrongylus abstrusus, en gatos, se puede lograr mediante pruebas fecales utilizando la técnica de Baermann (Figura 17).

La interpretación de las muestras traqueales y de lavado broncoalveolar se basa en el análisis del tipo, número y proporción de células obtenidas. Estos datos, en conjunto con los resultados clínicos, radiográficos y de otras pruebas de imagen, son fundamentales para contribuir a la formulación de un diagnóstico definitivo.

Los patrones comúnmente identificados^1,3,4 son los siguientes:

Esta categoría está compuesta por muestras en las que no se obtiene material celular en número adecuado, o el material está distorsionado de manera artefactual por sangre, mala conservación o artefactos de procesamiento de tal manera que no se puede emitir un diagnóstico. Incluidas en esta categoría están las muestras de LBA compuestas exclusivamente de epitelio respiratorio que indican que no se ha alcanzado el espacio alveolar de forma eficiente, y todas aquellas con presencia de células epiteliales escamosas, bacterias y Conchiformibius spp que indican la contaminación orofaríngea de la muestra.

Los valores de corte de todas las poblaciones celulares no se han estandarizado para muestras de lavado traqueal. El lavado broncoalveolar es la única técnica de muestreo pulmonar para la cual se han establecido y estandarizado recuentos celulares diferenciales normales, y aunque se ha observado cierta variabilidad ésta no es tan amplia.

La citología normal se caracteriza principalmente por macrófagos (80 %). En perros sanos, se acepta un máximo de 7 % de linfocitos, 5 % de neutrófilos, 6 % de eosinófilos, 1 % de mastocitos y 1 % de células epiteliales. En gatos sanos, la composición incluye igualmente macrófagos, con hasta un 5 % de linfocitos, 7 % de neutrófilos y 16 % de eosinófilos²¹.

La interpretación de la relevancia clínica del incremento de células inflamatorias (Tablas 3 y 4) es un proceso complejo.

Esta complejidad se debe a la capacidad limitada de respuesta de órganos específicos frente a distintos tipos de agresiones, la presencia de procesos inflamatorios secundarios y la considerable variabilidad de los valores citológicos en individuos sanos. Sin embargo, al analizar la respuesta inflamatoria del LBA y cotejarla con otros datos clínicos disponibles, como la evolución de los síntomas y los patrones observados en radiografías, se facilita mucho la priorización de posibles diagnósticos diferenciales y se considera que en el 25 % de los casos, la citología del líquido LBA permite alcanzar un diagnóstico definitivo¹³.

La inflamación aguda de tipo neutrofílico se caracteriza por una predominancia de neutrófilos (Figura 18), los cuales pueden mostrar cambios degenerativos. Estas células mantienen una morfología similar a la que poseen en la sangre periférica y es infrecuente encontrar formas hipersegmentadas.

Cuando los neutrófilos están aumentados, es importante examinar con detalle la presencia de bacterias (en particular intracelulares) y agentes infecciosos en general (Figura 19).

Su presencia indica una infección, pero su ausencia no puede descartarla, ya que la citología no es tan sensible como el cultivo y/o PCR²⁰.

La inflamación neutrofílica aguda se puede clasificar en dos categorías: séptica y no séptica, dependiendo de si se detectan bacterias intracelulares. Entre las causas sépticas se encuentran la neumonía bacteriana, la neumonía por aspiración o una infección bacteriana secundaria. Las posibles causas de una inflamación no séptica incluyen infecciones no bacterianas, tales como fúngicas, rickettsiales y protozoarias, además de la bronquitis crónica y el aumento de neutrófilos por lavados bronquiales repetidos.

La inflamación crónica activa (mixta) se diagnostica en base a un aumento en el número de neutrófilos y macrófagos activados, y puede observarse en condiciones infecciosas, no infecciosas o neoplásicas. El número de neutrófilos está aumentado en casi todas las enfermedades (infecciosas y no infecciosas) que causan inflamación. Los macrófagos activados pueden estar fagocitando restos, organismos o eritrocitos (Figura 20).

Las infecciones fúngicas respiratorias (blastomicosis, histoplasmosis o coccidioidomicosis) pueden asociarse con este tipo de inflamación.

La inflamación crónica se evidencia por un incremento en el número de macrófagos activados (citoplasma amplio, de aspecto espumoso y vacuolado), acompañados de una menor cantidad de neutrófilos, linfocitos reactivos y células plasmáticas. Aunque es común encontrar una subpoblación de macrófagos con estas características en las muestras de LBA, un predominio de ellos apunta a una condición más allá de lo habitual²¹ y puede ser causado por varias patologías, como la bronquitis crónica, neoplasias e infecciones.

La inflamación eosinofílica se diagnostica por un aumento en el número de eosinófilos y puede estar asociada con un incremento en el número de mastocitos. Los eosinófilos tienen gránulos que pueden parecer de color rojo oscuro a marrón (en contraste con el rojo anaranjado brillante en las preparaciones sanguíneas) y núcleos más segmentados que los neutrófilos. Al examinar las muestras, los gránulos de eosinófilos pueden estar presentes en el fondo y es importante no confundirlos con bacterias (Figura 21).

Los mastocitos se pueden distinguir fácilmente de los eosinófilos por sus grandes gránulos metacromáticos y núcleos redondos a ovales centralmente ubicados cuando son visibles. Es importante recordar que las vías respiratorias felinas normales tienen un recuento de eosinófilos más alto que el de los perros, y esto no debe confundirse con la enfermedad pulmonar eosinofílica.

La inflamación eosinofílica frecuentemente está causada por etiologías infecciosas como parásitos (Aelurostrongylus, Angiostrongylus, Capillaria spp, Dictyocaulus, Dirofilaria, Filaroides), por ello es importante examinar la muestra a bajo aumento en busca de larvas o huevos (Figuras 22 y 23), teniendo presente que su ausencia no es suficiente para descartar el parasitismo de la lista de diagnósticos diferenciales y se suele requerir de pruebas adicionales^22,23. La presencia de eosinófilos también puede ser una parte destacada en la respuesta inflamatoria frente a enfermedades bacterianas y fúngicas. Otras causas reportadas incluyen infiltrado pulmonar eosinofílico, asma/bronquitis felina y neoplasias.

La hemorrágica se puede dividir en aguda y crónica, y se diagnostica cuando hay un aumento de eritrocitos. Un número aumentado de eritrocitos no fagocitados indica una hemorragia aguda que probablemente sea iatrogénica. Los macrófagos que contienen eritrocitos fagocitados, cristales de hematoidina o partículas de hemosiderina (apariencia verde o marrón dorado) proporcionan evidencia de hemorragia crónica. La presencia de hemorragia crónica puede estar asociada con diversas condiciones que causan daño vascular o diapédesis eritrocitaria en el pulmón, incluyendo trauma, presencia de cuerpos extraños, coagulopatías, tromboembolismo, infecciones tanto bacterianas como fúngicas, neumonía por aspiración, hipertensión pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva y neoplasias.

La neoplasia primaria (linfoma, carcinomas, sarcomas, histiocitosis maligna) o metastásica puede identificarse ocasionalmente mediante LBA. El rendimiento depende en gran medida de la ubicación del tumor (afectación de árbol bronquial frente localización intersticial típica de los procesos metastáticos) y la calidad de la muestra obtenida (Figura 24).

Cuando se observan células neoplásicas suelen ser carcinomas o linfomas. Hay que prestar atención a la evaluación de los criterios nucleares y citoplasmáticos de malignidad, como la anisocitosis, anisocariosis y nucleolos múltiples y prominentes, pues puede resultar complicado en muestras con alta densidad celular, donde además existe el riesgo de confundir el epitelio respiratorio hiperplásico o reactivo con tejido neoplásico.

No disponemos de estudios específicos que evalúen utilidad del LBA en el diagnóstico de neoplasias malignas pulmonares, pero en medicina humana se ha visto que la citología del LBA tiene un alto rendimiento diagnóstico (64.8 %), comparable a la biopsia de aspiración con aguja transbronquial, y puede coincidir con el diagnóstico de tejido en un 36 % de los casos, también se informa que la citología de cepillado pudiera tener mayor sensibilidad y especificidad que la citología de LBA²⁴.

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