Estudio serológico de la infección por Leptospira spp. en gatos (Felis silvestris catus) en el sur de la provincia de Santa Fe, Argentina

La leptospirosis es causada por Leptospira spp. Los gatos pueden infectarse y enfermar. Los objetivos fueron:

• Realización del análisis serológico mediante Aglutinación Microscópica (MAT) en sueros de gatos con y sin sintomatología de afecciones renales a un punto de corte de 1:50.
• Determinación de la tasa de seropositividad a Leptospira spp. y la frecuencia de detección de serovares, mediante la MAT.
• Implementación de la técnica de Aglutinación Macroscópica con antígeno termorresistente (TR) en gatos serorreactivos a la MAT.

Se analizaron 320 sueros de gatos europeos pelo corto, de ambos sexos, distintas edades, 160 sanos (S) y 160 enfermos (E). Se obtuvieron 56 sueros reactivos, 50 del grupo E y 6 del S, tasa de seropositividad del 17,5 %. En 35 sueros del E se observaron reacciones cruzadas y los títulos más elevados para Pomona (1:6400), Canicola (1:1600) e Icterohaemorrhagiae (1:200). Los 21 sueros restantes fueron positivos a un solo serovar, 16 del E y 6 del S, dentro del E, la mayor frecuencia de detección fue para Castellonis y Bratislava seguidos por Autumnalis con títulos de 1:100 a 1:200. En el grupo S: Autumnalis y Bratislava seguidos por Castellonis y Grippotyphosa con título de 1:50. Se analizaron mediante la prueba de aglutinación macroscópica con antígeno termorresistente (TR), 9 sueros del grupo E y seis del S. Solo se obtuvieron 5 positivos en el grupo E. Se propone utilizar una dilución de 1:50 como punto de corte para la MAT. Los serovares detectados mayoritariamente fueron Castellonis, Bratislava y Autumnalis.

La leptospirosis es una enfermedad infecciosa contagiosa causada por espiroquetas patógenas de Leptospira spp. y es una de las zoonosis más difundidas a nivel mundial^{16, 25}. En Argentina reviste carácter endémico²⁵. Existe una clasificación serológica, L. interrogans sensu lato, que incluye alrededor de 250 serovares agrupados dentro de serogrupos, que infectan a los animales y humanos²⁰.

Los reservorios involucrados en la transmisión comprenden una diversidad de animales domésticos, como los cerdos, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros y silvestres dentro de los que se destacan los roedores. Los gatos son hospedadores accidentales de varios serovares que prevalecen en dichos reservorios y pueden adquirir la infección por medio de la ingesta de ratones infectados o de agua contaminada ^{16, 19}.

Sufren una colonización de los túbulos renales por parte de las leptospiras que, posteriormente, son excretadas en la orina durante períodos variables^{4, 5, 16}. El rol de los felinos domésticos (Felis silvestris catus) en la epidemiología de la leptospirosis ha recibido poca atención.Aunque existe evidencia serológica de exposición, la enfermedad clínica es raramente reportada y se conoce muy poco acerca de su significancia en esta especie⁴.

Se han observado casos clínicos en los que se ha comprobado que las leptospiras patógenas causan daño a nivel hepático y/o renal^{4, 5, 11}. Los gatos infectados con Leptospira spp., pueden eliminar las espiroquetas en la orina de forma intermitente durante varias semanas, constituyendo una fuente potencial de transmisión al medio ambiente^{16,19, 23}.

Los estudios de prevalencia serológica, son importantes para poder estimar el porcentaje de gatos infectados en la población de una provincia o país. Las tasas de prevalencia serológica halladas en distintas partes del mundo varían entre un 4,8 % y un 35 % dependiendo del área geográfica^{1, 2, 8, 9, 23}.En un estudio previo, realizado en el año 2009 en gatos de la ciudad de Rosario, sur de Santa Fe, se halló una tasa de seropositividad del 4 % y es el único antecedente registrado en la región del estudio⁹.

Para el diagnóstico serológico de la leptospirosis se emplea la técnica de Aglutinación Microscópica (MAT) que es serogrupo específica, siendo la más confiable a la que se remiten como referencia otras técnicas serológicas^{7, 12}.Además, existen pruebas serológicas género-específicas, que son útiles para detectar la leptospirosis en una etapa inicial. Una de las más utilizadas en humanos y en perros es la prueba de Aglutinación Macroscópica con Antígeno Termorresistente (TR).

El antígeno TR es una fracción termorresistente común al género Leptospira que reacciona frente a cualquier serovar^{12, 14}. Esta reacción se caracteriza por presentar positividad hacia el cuarto día del inicio de la enfermedad, haciéndose negativa hacia el día 45. Un resultado positivo siempre debe confirmarse con la prueba de referencia^{12, 14}.Debido a la escasa información acerca de tasas de seropositividad de la infección leptospirósica en gatos en la región, surge la necesidad de realizar este tipo de estudio. Los objetivos fueron:

• Realizar el análisis serológico mediante la MAT en sueros de gatos empleando una dilución de 1:50 como punto de corte.
• Determinar la tasa de seropositividad a Leptospira spp. y la frecuencia de detección de distintos serovares, mediante la MAT en gatos con y sin sintomatología clínica de afecciones renales.
• Implementar la técnica de aglutinación macroscópica con antígeno termorresistente (TR) en gatos con síntomas clínicos a nivel renal serorreactivos a la MAT para observar su utilidad en el diagnóstico de la leptospirosis.

La región del estudio comprendió asentamientos urbanos y suburbanos ubicados en el área del sur de la provincia de Santa Fe, Argentina. El clima es subtropical húmedo, siendo la humedad abundante debido a las precipitaciones que caen regularmente durante todo el año, alrededor de 970 mm anuales.

En este estudio, de tipo observacional descriptivo, realizado entre los años 2016 y 2019, se analizaron 320 sueros sanguíneos de gatos europeos de pelo corto, de ambos sexos, de distintas edades, que se diferenciaron en dos grupos, uno de 160 animales clínicamente sanos provenientes de campañas de castraciones masivas (S) y otro de 160 animales pacientes de Consultorios Veterinarios (E).

La mayoría de los gatos analizados tenían propietarios, sus estilos de vida eran tanto de indoor/outdoor, cazaban roedores y otras presas y algunos convivían con gatos y/o perros.Los perros convivientes no presentaban vacunación reciente contra Leptospira spp. Dentro del grupo E, se destacaron 9 gatos con antecedentes clínicos, tales como signos y síntomas de afecciones a nivel renal y análisis bioquímicos de sangre que mostraron datos compatibles con una presunta leptospirosis.

Los signos y síntomas descriptos para algunos de esos gatos fueron: depresión, anorexia, fiebre, deshidratación, ictericia, adelgazamiento progresivo, hematuria, polaquiuria, gingivitis, legañas sanguinolentas y zonas de necrosis en la lengua (Figura 1).

Las alteraciones detalladas en los perfiles bioquímicos fueron: valores incrementados de urea y creatinina, así como del recuento de glóbulos blancos con alta cantidad de neutrófilos en banda. Los valores de aspartato aminotranferasa y fosfatasa alcalina fueron variables, algunos gatos presentaron valores aumentados y otros normales. Las muestras de sangre para el estudio serológico, se obtuvieron por punción venosa, se separó el suero y se conservó a -20°C.

Para la MAT, se emplearon cepas de referencia de los siguientes serovares de Leptospira spp.: Leptospira interrogans: Pomona Pomona; Icterohaemorrhagiae Copenhageni M 20; Canicola Canicola Hond Utrech IV; Australis Bratislava Jez bratislava; Pyrogenes Salinem; Sejroe Hardjo type Prajitno Hardoprajitno, Autumnalis Autumnalis Akiyami A, Bataviae Bataviae Swart; L. kirschneri Grippotyphosa Moskva V; Cynopteri Cynopteri 3522 C y L. borgpetersenii Ballum Castellonis Castellón 3, de ceparios proporcionados por Laboratorios de Referencia en leptospirosis de Argentina.

Se utilizaron antígenos cultivados semanalmente en el medio líquido de EMJH (Difco®). La MAT se desarrolló en dos etapas: en la primera se seleccionaron los sueros utilizando una dilución inicial de 1:50 y en la segunda, se realizó una titulación final de los sueros positivos.

Se implementó la microtécnica en placas con pocillos en fondo en u, en cada uno de los cuales se colocaron mediante micropipetas calibradas, 50 µl de la dilución de suero y se adicionó un volumen equivalente del antígeno correspondiente. La placa conteniendo las mezclas se incubó a 30 °C por 2 horas.

Posteriormente, se tomó parte de la mezcla con ansa de platino calibrada, se transfirió a la superficie de un portaobjeto de vidrio y se observó en un microscopio de campo oscuro con un aumento de 200 X. Se consideraron positivos, los sueros en los que se observó al menos el 50% de las leptospiras aglutinadas en comparación con un testigo (leptospiras vivas más solución fisiológica a pH 7,5), a una dilución ≥1.50.

La prueba de aglutinación macroscópica con antígeno termorresistente (TR) se implementó introduciendo una modificación a la metodología empleada por Seijo y Mazzonelli²⁴. Se elaboró una suspensión del antígeno termorresistente utilizando la cepa de L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrech IV, cultivada en el medio de EMJH. Luego de 10 días de incubación a 30 °C, se controló para observar el desarrollo de focos de autoaglutinación y se agregó formol al 10 % vol/vol en agua, a una concentración final del 2 %.

El cultivo se concentró por centrifugación a 10.000 g por 30 minutos. El antígeno se extrajo mediante ebullición: 100 °C durante 30 minutos. Antes de su utilización, se homogeneizó con una solución de Na Cl más glicerol llevándose a una concentración comparable a la del tubo 10 de la escala de Mc Farland, finalmente, se estabilizó una semana en heladera a 4 °C.

Se evaluó la eficacia del antígeno, realizando controles con sueros positivos y negativos a la MAT. La técnica se llevó a cabo en portaobjetos, enfrentando 30 µl del suero más una cantidad equivalente de suspensión densa del antígeno TR de Leptospira interrogans Canicola Canicola Hond Utrech IV.La lectura de la reacción se realizó en el lapso de 2 minutos en un aglutinoscopio, interpretándose como positivos aquellos sueros en los que se observó aglutinación franca en la periferia de la mezcla²¹.

Se obtuvieron 56 sueros reactivos a la MAT, hallándose sobre el total de las muestras, una tasa de seropositividad a Leptospira spp. del 17,5 %. Dentro de éstos, 50 pertenecieron al grupo E (31,25 %) y 6 (3,75 %), al grupo S (Tabla 2). Del total de animales serorreactivos, se hallaron 35 (62,5 %) pertenecientes al grupo E que presentaron reacciones cruzadas frente a dos o más serovares, siendo los principales detectados en forma simultánea: Pomona, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Bratislava, Grippotyphosa, Castellonis y Autumnalis.

Dentro de éstas reacciones se observaron los títulos más elevados para Pomona (1:6400), Canicola (1:1600) e Icterohaemorrhagiae (1:200). Los 21 (37,5 %) sueros restantes fueron positivos frente a un solo serovar, 16 (76,19 %) del grupo E y 6 (23,81 %) del grupo S. La frecuencia de detección hallada para los serovares individuales en el grupo E fue: Castellonis y Bratislava 5 sueros cada uno (10/16), Autumnalis 3 sueros (3/16), Grippotyphosa, Pomona y Canicola con 1 suero cada uno (3/16), el título más elevado fue de 1:200 para Pomona y Castellonis, seguido de 1:100 para Bratislava.

En el grupo S, se detectaron: Autumnalis, 2 sueros (2/6) y Bratislava, 2 (2/6), Castellonis y Grippotyphosa, 1 suero cada uno (2/6), en todos los casos el título hallado fue de 1:50. No se detectó reactividad individual a Hardjo, Bataviae, Cynopteri y Pyrogenes en la totalidad de los sueros analizados. Se analizaron mediante la prueba de aglutinación macroscópica con antígeno termorresistente (TR), 9 sueros de gatos con sospecha de la enfermedad del grupo E y seis de gatos del grupo S, todos serorreactivos a la MAT. Los resultados obtenidos permitieron observar 5 (5/9) sueros positivos dentro del grupo E, mientras que los 6 (6/6) sueros del grupo S fueron negativos para esta prueba (Tabla 1 y 2).

La tasa de seropositividad hallada en este estudio para el total de las muestras fue semejante a la reportada previamente por autores de trabajos similares realizados en Marruecos en 2014, Alemania en 2017 y en Malasia en 2019^{6, 26, 2}. La dilución adoptada como punto de corte para el análisis mediante la prueba de Aglutinación Microscópica, fue seleccionada en base a experiencias previas, tanto de otros autores como propias, en las que se observó un aumento en la sensibilidad de la técnica diagnóstica cuando se utilizaron diluciones <1:100^{1, 2, 17, 22}.

De acuerdo con esto, la tasa de seropositividad hallada para los gatos del grupo E fue concordante con la reportada por Mylonakis, que adoptó el mismo punto de corte en la MAT, para el análisis de una población de gatos enfermos provenientes de un hospital veterinario en Grecia¹⁷.

De haberse implementado en este estudio un punto de corte ≥1:100, se habría perdido la detección de más del 50 % de los sueros reactivos. La tasa de seropositividad más elevada se halló para el grupo E conformado por gatos que mayoritariamente presentaron síntomas de patologías renales.

Estos resultados sugieren que la infección por Leptospira spp. puede haber jugado un rol importante en la causalidad de la patología a ese nivel. Otros autores, en reportes previos publicados sobre leptospirosis clínica en gatos, refieren que la mayoría de los animales demostró algún grado de alteración patológica a nivel renal con valores incrementados de urea y creatinina y en algunos casos se observó hematuria^{1, 4, 27}.

Por esta razón sería necesario incluir a la leptospirosis en el diagnóstico diferencial de causas probables de patologías a nivel renal. Debido a la falta de consideración por parte de los profesionales Veterinarios, la enfermedad está siendo subdiagnosticada y eso genera confusión acerca de la importancia que reviste en la salud de los gatos.

Los resultados del análisis serológico permitieron observar que solo dos gatos del grupo E mostraron títulos elevados >1:800 a algunos serovares de Leptospira spp., en los restantes, el máximo título detectado fue de 1:200. Reportes previos afirman haber hallado títulos elevados >1:800 en gatos con sintomatología clínica sospechosa de leptospirosis y principalmente este hallazgo fue en relación con la detección del serovar Pomona^{4, 6, 16, 27}.

Los resultados positivos a la MAT correspondientes a nueve casos sospechosos del grupo E (ver Tabla 1), sugieren que los gatos podrían haber estado cursando una leptospirosis aguda en el momento de la extracción de sangre en el Consultorio Veterinario. Esto se pudo corroborar mediante el análisis de muestras pareadas solamente en el caso nro. 9, para el cual, en el análisis de la segunda muestra se obtuvo el mismo título elevado frente a Pomona e Icterohaemorrhagiae con la negativización frente a Bratislava.

Asimismo, las coaglutinaciones (reacciones cruzadas entre serovares con títulos superiores al punto de corte) observadas durante la etapa inicial de la leptospirosis, que también fueron registradas por otros autores en investigaciones de gatos con leptospirosis clínica, constituyeron una razón adicional para considerar a los animales del grupo E sospechosos de padecer la enfermedad^{4, 6, 22}.

Además, en el 55,55 % de estos sueros (ver Tabla 1), el diagnóstico positivo fue corroborado mediante la prueba género-específica del TR. El hecho de que el 44,45 % de los sueros restantes haya sido negativo, quizás se haya debido al tiempo transcurrido desde la infección, que podría haber excedido el límite de sensibilidad de dicha prueba diagnóstica^{14, 21}.

En cuanto a los serovares detectados mediante la MAT, se destacaron los serovares Canicola e Icterohaemorrhagiae como parte de las reacciones cruzadas observadas en los sueros de gatos con sospecha de la enfermedad. De acuerdo a sus hábitos los gatos eran cazadores y tenían contacto con perros y roedores, lo que podría indicar en estos casos, que esos hospedadores de mantenimiento pueden haber sido posibles fuentes de infección^{3, 6, 16, 19, 23}.

No se observaron diferencias en cuanto al sexo, pero sí en cuanto a la edad. Los animales enfermos fueron adultos, hecho que también ha sido reportado^{4, 5, 14, 22}. No se puede subestimar el papel de los serovares Pomona, Cynopteri y Bataviae debido a la baja frecuencia de detección, porque han sido detectados por otros autores en gatos de otros países^{4, 16, 23}.

Además, la observación en este estudio, de un gato con síntomas clínicos de enfermedad aguda y un título elevado a Pomona dentro de las reacciones cruzadas, sugiere que debe ser tenido en cuenta en la población analizada. La alta frecuencia de detección de Castellonis y Autumnalis también fue observada por otros autores de trabajos similares^{2, 4, 16}.

Es importante seguir investigando el rol de estos serovares en la epidemiología de la infección por Leptospira spp. en los gatos. La naturaleza de estos serovares y su frecuencia de detección, parecerían indicar que L. interrogans y L. borgpetersenii son las principales especies asociadas a la infección de los felinos domésticos del área del estudio. A tal fin, se propone continuar con el análisis serológico incluyendo éstos y otros serovares de Leptospira spp. aún no monitoreados en la región.

Los resultados positivos obtenidos a partir de los sueros del grupo S, indicarían que los gatos estuvieron expuestos a la infección con Leptospira spp. y que los títulos bajos de anticuerpos observados podrían ser producto de una respuesta inmunológica específica remanente contra los serovares involucrados en la infección o contra otros antigénicamente emparentados.

Una limitación importante de este trabajo es que no se realizó un muestreo pareado, no pudiendo establecerse si esos animales tenían una infección activa. Al respecto, la bibliografía existente menciona que algunos gatos pueden cursar la enfermedad sin manifestar cambios clínicos patológicos ni títulos de anticuerpos elevados^{1, 11, 15, 22}.

Estos antecedentes ponen de manifiesto la necesidad de continuar investigando el papel de la leptospirosis en gatos con títulos de anticuerpos bajos, con o sin manifestaciones clínicas, debido a que se ha comprobado que pueden comportarse como potenciales fuentes de infección para el medio ambiente^{19, 23}

En cuanto a la prueba del TR, los gatos en su mayoría, llegan a la consulta veterinaria cuando están padeciendo la etapa crónica de la enfermedad y no resulta posible captar las IgM producidas en la etapa inicial. A pesar de las limitaciones de la técnica, se observó una concordancia importante con los resultados de la MAT, lo que sugiere su utilidad en el diagnóstico inicial de la leptospirosis en los gatos, pero es necesario continuar con los ensayos en esta especie.

En conclusión, de acuerdo a lo observado en este estudio, se propone utilizar una dilución de los sueros de 1:50 como punto de corte para el diagnóstico serológico mediante la MAT en los gatos. Los serovares L. borgpetersenii Ballum Castellonis, L. interrogans Australis Bratislava Jez bratislava y L. interrogans Autumnalis Autumnalis fueron observados como los mayoritariamente asociados a los felinos domésticos del área de estudio.

También es importante destacar la participación de los serovares de L. interrogans, Pomona, Canicola e Icterohaemorrhagiae con los títulos más elevados en aquellos casos considerados infecciones activas por ambas técnicas serológicas. Es necesario desarrollar inmunógenos destinados a prevenir la enfermedad en los gatos, los cuales deberían contener dichos serovares. También, los resultados sugieren que la técnica género específica del TR sería útil para complementar el diagnóstico serológico realizado con la MAT en gatos con una infección activa por Leptospira spp.

Agradecimientos

Este trabajo fue realizado mediante subsidios otorgados por la Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Se agradece especialmente a las Médicas Veterinarias que colaboraron en la extracción de las muestras, así como a los propietarios de los animales por otorgar gentilmente su consentimiento.

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