by MultimédicaDiagnóstico del linfoma y la leucemia canina
Resumen breve
El diagnóstico y clasificación actual tanto histológica como citológica de los linfomas y las leucemias (actualizada por la OMS y Kiel, respectivamente) requiere la identificación de las diferentes líneas linfocitarias, para lo cual, además del examen directo microscópico de la morfología celular y la arquitectura ganglionar, de forma rutinaria será necesario recurrir a técnicas de inmunofenotipado como la inmunohistoquímica, la citometría de flujo o test de clonalidad (PARR).Índice de contenidos
Introducción
El diagnóstico y clasificación actual tanto histológica como citológica de los linfomas y las leucemias (actualizada por la OMS y Kiel, respectivamente) requiere la identificación de las diferentes líneas linfocitarias, para lo cual, además del examen directo microscópico de la morfología celular y la arquitectura ganglionar, de forma rutinaria será necesario recurrir a técnicas de inmunofenotipado como la inmunohistoquímica, la citometría de flujo o test de clonalidad (PARR). La citometría de flujo es uno de los mejores métodos disponibles para definir el inmunofenotipo celular ya que permite un enfoque multiparamétrico y la disponibilidad de un panel amplio de anticuerpos en comparación con otras técnicas, pero desgraciadamente, tiene algunas limitaciones, como lo son, la imposibilidad de correlacionarla con la estructura tisular y la limitación comercial de los anticuerpos.
De esta forma, el diagnóstico y clasificación precisa de las neoplasias hemolinfáticas caninas, por norma general, requerirá el uso de varias técnicas laboratoriales.
Linfomas de células B
Linfoma difuso de células B grandes
Histológicamente, el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se caracteriza por una proliferación e infiltración difusa del ganglio linfático, por parte de grandes células linfoides neoplásicas con un tamaño nuclear más de dos veces superior al de los glóbulos rojos. La variante centroblástica es la más frecuente y se caracteriza por una proliferación difusa de células linfoides grandes, que se asemejan a las células proliferantes del centro germinal (CG) con núcleos ovales a redondos, con cromatina fina, y citoplasma basófilo y escaso. Los nucléolos por regla general son siempre visibles y múltiples. La variante inmunoblástica en perros es menos frecuente y se considera clínicamente más agresiva. Mediante inmunohistoquímica (IHC), los DLBCL expresan CD79, CD20, y el factor de transcripción nuclear PAX5.
Citológicamente, los linfocitos de los linfomas de células B grandes pueden ser de tamaño variable, pero a menudo son de 1 a 1.5 veces el tamaño de un neutrófilo, con un núcleo más grande, cromatina inmadura dispersa, a menudo de 1 a 2 nucleolos prominentes de gran tamaño y una pequeña cantidad de citoplasma profundamente basófilo. El citoplasma puede contener un pequeño número de pequeñas vacuolas claras y es frecuente la presencia de figuras mitóticas (Figura 1).
Figura 1. Aspecto citológico característico de linfoma de células B grandes.
Aunque puede añadir alguna información útil al diagnóstico del linfoma B, sobre todo desde el punto de vista pronóstico, el fenotipado mediante citometría no es actualmente capaz de distinguir entre las diferentes variantes de linfomas de células B. Sin embargo, al igual que sucede con la IHQ la mayoría de los linfomas de células B diagnosticados en perros son positivos tanto para CD21 como para CD79, mientras que los linfomas CD21-/CD79+ y CD21+/CD79- son menos frecuentes. El tamaño celular determinado por la citometría de flujo puede ayudar a clasificar mejor las neoplasias de células B, pues al igual que sucede en la citología y en la histología, los DLBCL tienen células de gran tamaño, mientras que los linfomas B foliculares y difusos pequeños, se caracterizan por células más pequeñas (Figura 2). Desgraciadamente, la mayoría de los linfomas B aparecen como de tamaño mediano a grande y la identificación de células grandes no descarta subtipos distintos del DLBCL.
Figura 2. Citometría de flujo característica de un linfoma de células B grandes, que destaca por la mayoritaria expresión de CD21 y un tamaño celular promedio alto (FSC).
En este contexto, la determinación de Ki67, un antígeno de proliferación, puede ayudar a discriminar entre formas de alto y bajo grado. Sin embargo, se ha descrito como los linfomas de la zona marginal (MZL) diagnosticados histológicamente pueden presentar tamaño de citometría de flujo variable (medio a grande) y valores variables de Ki67 (indicativo de formas de bajo y alto grado). Por lo tanto no es posible diferenciar los MZL de gran tamaño y alto Ki67 de los DLBCL mediante citometría de flujo únicamente. Además, esta presentación inmunofenotípica puede coincidir con una etapa tardía de la enfermedad con un comportamiento más agresivo o, como se ha descrito en humanos puede representar una transformación de MZL en DLBCL.
Por el momento no se describen diferencias inmunofenotípicas de los distintos subtipos de linfomas de células B caninos. Esto limita el papel actual la citometría de flujo en la sub clasificación de los linfomas de células B.
La citometría de flujo es una herramienta excelente para la estatificación del linfoma (es decir, para identificar infiltración de células neoplásicas en diferentes tejidos), en particular en matrices fluidas como la sangre periférica y la médula ósea (MO). La principal ventaja es que permite examinar de poblaciones con la misma dispersión y propiedades inmunofenotípicas de la lesión primaria. Se han descrito buenos resultados analíticos en la cuantificación de la infiltración de sangre periférica y MO en perros con linfomas de células grandes. Dada la buena exactitud y precisión y las diferencias en los resultados proporcionados entre observadores en la evaluación directa del frotis, la citometría de flujo parece ser un método más fiable en comparación con la observación al microscopio. Se identificó una sensibilidad de 0.5 y 2 % en sangre y médula ósea, respectivamente, y un valor de corte diagnóstico de 0.56 y 2.45 % para la detección por citometría de flujo de células B grandes neoplásicas. En cualquier caso, parecen aceptables, especialmente teniendo en cuenta el umbral pronóstico del pronóstico del 3 % para la infiltración de médula ósea en DLBCL. Por el contrario, no se han descrito valores de corte en sangre periférica valor pronóstico.
Un estudio en el que se evaluó la enfermedad mínima residual en los ganglios linfáticos y en la médula ósea, halló sólo una concordancia moderada entre la citometría de flujo y PARR al final de la quimioterapia en perros con DLBCL. Un estudio reciente demostró que un porcentaje > 0.5 % de células grandes CD21+ en los ganglios linfáticos, era predictivo de un tiempo más corto hasta la recaída en perros con DLBCL en aparente remisión clínica completa.
Linfomas de células T
Linfoma de células T periféricas
El linfoma de células T (TCL) es un grupo heterogéneo de neoplasias linfoides procedentes de células T. A pesar de la gran variabilidad, la mayoría de los TCL en el perro están representados por el llamado linfoma de células T periféricas (PTCL) no especificado (NOS), según la clasificación de la OMS. El linfoma de la zona T (TZL) y el linfoma linfoblástico (LL) son otros dos tipos de TCL relativamente frecuentes, mientras que el linfoma de células T asociado a enteropatía, el linfoma epiteliotrópico cutáneo, el linfoma mediastínico y el linfoma hepatoesplénicos, son menos habituales. La clasificación de Kiel, identificaba a cada uno de los diferentes subtipos citológicos de TCL, confirmando así su morfología extremadamente heterogénea. De acuerdo con este esquema, el TCL podría dividirse en TCL de grado bajo, caracterizados por un comportamiento indolente, y TCL de grado alto, caracterizados por un curso muy agresivo con un tiempo de supervivencia medio estadísticamente inferior al de su homólogo de células B.
El linfoma de células T periféricas (PTCL) es el subtipo de TCL más frecuente y comprende un grupo heterogéneo de diferentes inmunofenotipos con diferentes presentaciones citológicas y resultados variables (Figura 3).
Figura 3. Aspecto citológico de linfoma de células T grandes, caracterizado por el pleomorfismo nuclear y la presencia de núcleos cerebriformes.
Según el esquema de clasificación de Kiel actualizado y adaptado al perro, los PTCL se caracterizan por seis subtipos morfológicos, como son: linfomas pleomórficos de células pequeñas, de células pequeñas y claras, pleomórficos mixtos, pleomórficos de células grandes, inmunoblásticos y plasmocitoides.
Entre los PTCL, el fenotipo más frecuente es CD45+CD3+CD4+MHCII-/bajo. En todos los subtipos de PTCL, la expresión de CD5 suele ser positiva, pero la pérdida de CD5 y CD3 puede producirse de forma irregular y podría tener un posible significado pronóstico (Figura 4).
Figura 4. Citometría de flujo característica de un linfoma de células T de células periféricas, que destaca por la mayoritaria expresión de CD45, CD3 y CD4, la pérdida de CD5, la baja expresión de MHCII y un tamaño celular promedio alto (FSC).
El CD25 es generalmente negativo, lo que sugiere que se trata de células inactivas.
Los inmunofenotipos menos frecuentes de los PTCL son CD45+CD3+CD8+MHCII y CD45+CD3+CD8CD4-MHCII, que representan aproximadamente el 11.9 y el 13.5 % de los linfomas de células T, respectivamente.
Linfoma linfoblástico
El linfoma linfoblástico (LL) es un subtipo de linfoma de alto grado de malignidad de células T identificado en aproximadamente el 10 % de los casos de linfomas T y en aproximadamente el 3 % de los linfomas caninos. Según la clasificación de la OMS, el LL es una variante sólida de la leucemia aguda de células T y generalmente se clasifica como una neoplasia que se origina a partir de células precursoras. A pesar de estar constituido por una población homogénea de células pequeñas sin un nucléolo evidente, el LL es un linfoma agresivo de alto grado, y el índice mitótico es a menudo muy alto. Un estudio describió una alta prevalencia de LL en la raza Bóxer, con un curso menos agresivo y una mayor supervivencia. En cuanto a la citometría de flujo, el inmunofenotipo prevalente del LL es similar al del PTCL (CD45+CD3+CD4+MHCII-), y a pesar del supuesto origen en células precursoras, el CD34 es generalmente negativo.
Linfoma de la zona T
El linfoma de la zona T (TZL) es una forma de linfoma indolente de grado bajo que aparece en aproximadamente el 10 % de los casos de linfomas T. Citológicamente, el TZL puede describirse como un linfoma linfocítico de células pequeñas y claras. Las células neoplásicas se reconocen fácilmente mediante por su característica pérdida de CD45 y por la frecuente expresión aberrante de CD21, en el contexto de un linfoma CD3+CD5+MHCII+. La expresión de CD4 y CD8 puede variar (CD4+CD8-, CD4-CD8+, CD4-CD8- o CD4+CD8+) sin que exista una correlación evidente con el resultado (Figura 5).
Figura 5. Citometría de flujo característica de un linfoma de células T de células claras y pequeñas o linfoma de la zona T, que destaca por la perdida expresión de CD45, la marcación CD5, la expresión variable de CD4/CD8 y un tamaño celular promedio bajo (FSC).
Debido a su fenotipo tan característico, el TZL puede ser fácilmente reconocible en sus fases iniciales, cuando todavía existe una población mixta de linfocitos residuales no neoplásicos, en casos de linfomas concurrentes en el seno del ganglio o cuando se detecta en tejidos no linfoides, como la sangre periférica y la médula ósea, que se infiltran en más del 90 % de los casos. Citológicamente, este tipo de linfomas son también muy reconocibles se caracterizan por estar compuestos por linfocitos de pequeño tamaño cuyos citoplasmas hacen una única prominencia otorgándoles un aspecto de espejo de mano (Figura 6).
Figura 6. Aspecto citológico de linfoma de células T de células claras y pequeñas o linfoma de la zona T, caracterizado por linfocitos de tamaño pequeño con colas de citoplasmáticas (forma de espejo de mano).
La baja tasa de proliferación celular (Ki67) descrita en los casos de TZL, apoya la baja agresividad del tumor. Varios estudios confirman el comportamiento indolente de este subtipo, lo que hace innecesaria la quimioterapia agresiva en la mayoría de los perros con TZL.
Leucemias crónicas
Las leucemias crónicas suelen ser más fáciles de clasificar basándose en la morfología que otros trastornos linfoproliferativos, ya que muestran una diferenciación reconocible. Aunque en perros y gatos se observan tanto formas mieloides como linfoides, la leucemia linfoide crónica (LLC) es mucho más frecuente que la leucemia mieloide crónica. La LLC canina generalmente se divide en dos categorías principales: LLC de células B (LLC-B) y LLC de células T CD8 (LLC-T). Los datos publicados sugieren que la LLC-T es más común que la LLC-B en perros y se han descrito características pronosticas entre estos fenotipos.
Leucemia crónica de células B
En medicina veterinaria se define la leucemia linfocítica crónica de células B como la expansión de células B neoplásicas diferenciadas de células pequeñas en la sangre periférica (Figura 7).
Figura 7. Citometría de flujo característica de una leucemia crónica de linfocitos B que destaca por la perdida expresión de CD34, la marcación CD21 y un tamaño celular promedio bajo (FSC).
Recientemente, se examinaron 491 casos de LLC-B canina, que se definieron como aquellos con más de 5000 linfocitos/ml en la sangre periférica, siendo más del 60 % de los linfocitos pequeños CD21. Como era de esperar, las citopenias periféricas son frecuentes y aproximadamente el 25 % de los casos presentan hiperglobulinemia. Una proporción significativa de los perros presentaba linfadenopatía periférica, esplenomegalia y linfadenopatía visceral, lo que apoya el uso de la terminología LLC-B/linfoma de células pequeñas. Los estudios previos sobre la LLC han excluido los casos con linfadenopatía significativa, lo que puede haber subestimado la prevalencia declarada de la LLC-B. Ciertas razas, en particular los perros de razas pequeñas, presentan un mayor porcentaje de casos de LLC-B, mientras que las razas grandes, están muy poco representadas. La LLC-B suele afectar a perros mayores, con una edad media de diagnóstico de 10 a 11 años.
La LLC-B es con frecuencia un hallazgo incidental y suele tener una evolución indolente, aunque hay indicios de que una edad más temprana en el momento del diagnóstico puede ser un indicador de mal pronóstico. En un estudio de perros con linfocitosis de células B, el tamaño pequeño de las células, determinado por citometría de flujo, se asoció con una evolución indolente y un tiempo de supervivencia de más de 1000 días. Otro estudio que evaluó el resultado en 17 perros con LLC-B determinó un tiempo medio de supervivencia de 480 días.
En línea con la naturaleza indolente de esta enfermedad, la mayoría de los casos de LLC-B están constituidos por una población mayoritaria de linfocitos pequeños de apariencia madura. Estos linfocitos suelen ser más pequeños que los neutrófilos, contienen núcleos pequeños y redondos, cromatina condensada, ausencia de nucléolos aparentes y pueden contener restos de citoplasma basofílico (Figura 8).
Figura 8. Aspecto citológico de una leucemia linfocítica crónica, caracterizado por el elevado número de células linfoides de aspecto pequeño-intermedio (1.5 glóbulos rojos).
La mayoría de los casos de LLC-B contienen una proporción menor de linfocitos más grandes, de tamaño intermedio, que pueden ser del mismo tamaño o ligeramente más grandes que un neutrófilo. La citometría de flujo revela que, en concordancia con la apariencia morfológica, las propiedades de dispersión sitúan a la mayoría de las células dentro del área en la que se encuentran los linfocitos pequeños normales. La proporción variable de células de tamaño intermedio morfológicamente típicas puede observarse extendiéndose desde esta zona de células pequeñas hasta la zona en la que normalmente se encuentran las células más grandes, como los monocitos.
Leucemia crónica de células T
Lo que se ha descrito como leucemia crónica de células T (LLC-T) canina es probablemente un grupo heterogéneo compuesto por linfoma/leucemia de la zona T y LLC-T CD8. Las células de LLC-T CD8 son variablemente granulares y a menudo se denominan leucemias de linfocitos granulares grandes (LGL). Este grupo de LLC-T es la forma más común de LLC en perros, con una evolución indolente de la enfermedad. Históricamente, estas dos enfermedades se combinaban, hasta que se descubrió que las células de la zona T carecían de expresión del antígeno CD45. Muchos de los antiguos estudios sobre la LLC-T CD8 probablemente incluían casos tanto de leucemia/linfoma de zona T CD8 como de LLC-T CD8.
Ahora que estas dos enfermedades pueden diferenciarse fácilmente mediante citometría de flujo, la LLC-T CD8 (definida como células T CD8 CD45) sigue siendo un trastorno linfoproliferativo canino común y parece tener una evolución indolente (Figura 9).
Figura 9. Citometría de flujo característica de una leucemia crónica de linfocitos T citotóxicos que destaca por la perdida expresión de CD34, la marcación positiva de CD5/CD8 y un tamaño celular promedio bajo (FSC).
La LLC-T CD8 afecta a animales más viejos con una edad media de 10 años en el momento del diagnóstico y generalmente afecta a perros de razas grandes. La LLC-T CD8 puede estar asociada con esplenomegalia y anemia, pero otras citopenias son relativamente raras. Un estudio que evaluó los resultados en 19 perros con LLC-T CD8 determinó que la enfermedad tenía una supervivencia media de 930 días y que la anemia severa estaba relacionada con un peor pronóstico. Un estudio que evaluó el nivel de linfocitosis determinó que los perros con un recuento de más de 30.000 linfocitos/mL tenían un tiempo de supervivencia significativamente más corto (131 días) que los perros con menos de 30000 linfocitos/ml (1098 días).
Las células de LLC-T CD8 suelen ser de tamaño intermedio, con un núcleo pequeño, redondo o ligeramente dentado, con cromatina aglomerada, sin nucléolos aparentes, y un citoplasma de color azul pálido de moderado a muy expandido. Un número variable de células, pueden contener una cantidad variable gránulos azurófilos pequeños y definidos. No se sabe si la LLC-T CD8 granular tiene un comportamiento biológico diferente al de la LLC-T CD8 agranular, pero estudios previos no han identificado diferencias en el pronóstico. S estima que un pequeño subgrupo de LLC-T CD8 granulares pueden ser leucemias de células natural killers, pero actualmente no es posible identificarlas de forma precisa, por lo que carecemos de información sobre el comportamiento biológico de estos tumores.
Algunas infecciones crónicas por Ehrlichia canis pueden dar lugar a una expansión homogénea de células T CD8, por lo que en caso sospecha y linfocitosis inferior a 30000 células/ml, puede estar recomendada la realización de pruebas serológicas para descartar la infección.
Leucemias agudas
Las leucemias agudas son neoplasias agresivas de células hematopoyéticas inmaduras y pueden ser de origen linfoide (leucemia linfocítica aguda [LLA]), origen mieloide (leucemia mieloide aguda leucemia [LMA]) o indiferenciada (leucemia aguda indiferenciada). Se describen en función de las características clínicas, incluidos los porcentajes de células blásticas circulantes, citopenias acompañantes y/o falta de linfadenopatía periférica marcada, o estrictamente en la expresión superficial del marcador de células madre CD34.
La expresión del marcador de células madre CD34 es un marcador objetivo de leucemia aguda, pero hay evidencia tanto en seres humanos como en animales de que no todas las leucemias agudas expresan este antígeno (Figura 10).
Figura 10. La expresión de CD34 es el marcador típico de todas las leucemias agudas.
En 3 estudios que incluyeron de 8 a 25 casos, aproximadamente el 75 % de los casos definidos clínicamente de leucemia aguda canina expresaron CD34. Algunos estudios han descrito mediana de supervivencia de 9 a 16 días para los casos de leucemia aguda CD34. Surgen dificultades adicionales para distinguir la leucemia linfoblástica aguda del linfoma en estadio V avanzado en pacientes veterinarios, que a menudo se basa en una evaluación un tanto subjetiva de la magnitud de la afectación de los ganglios linfáticos periféricos.
La evaluación morfológica de las células blásticas puede variar y generalmente no se ha definido de forma clara, lo que, complica el diagnóstico de los diferentes tipos de leucemias agudas caninas.
Las leucemias agudas CD34 carecen sistemáticamente de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II (Figura 11).
Figura 11. Citometría de flujo característica de una leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B que destaca por la alta expresión de CD34, la marcación positiva de 21 (aunque a un nivel bajo en este caso), una baja expresión del MHCII y un tamaño celular promedio alto (FSC).
En una revisión de 194 casos de leucemia CD34+/MHCII- se identificaron 3 subconjuntos inmunofenotípicos principales: CD5, CD14 y doble negativos CD5/CD14 o indiferenciados. Los casos de CD5+/CD34+ parecen ser compatibles con LLA de células T y los CD14+/CD34+ con LMA. Además de las células CD34, los casos de LMA tienen consistentemente un subconjunto de células CD14 que han perdido la expresión normal del MHCII. La mediana de edad al diagnóstico fue de 8.3 años con un rango de 2 a 15 años. Las citopenias eran comunes, y a menudo afectaban severamente a las 3 líneas celulares.
Las leucemias agudas tienen una morfología variable. Las células son a menudo de tamaño intermedio a grande con un núcleo grande, cromatina dispersa, nucleolos variablemente prominentes y cantidades pequeñas a moderadas de citoplasma. En casos raros de leucemia aguda, las células precursoras pueden ser bastante pequeñas y carecer de nucléolos evidentes, lo que dificulta el diagnóstico. En estos casos, la presencia de citopenias significativas puede ser la única pista de que no se trata de una forma de leucemia crónica. La superposición morfológica entre las leucemias mieloide aguda y linfoide puede ser sustancial.
En comparación con la LLA o la leucemia aguda indiferenciada, las células de la AML pueden tener un núcleo de forma más irregular, una relación núcleo:citoplasma más baja, vacuolas de tamaño variable y/o gránulos rosados o morados. Los casos de AML a menudo progresan hacia cierto grado de apariencia monocítica, mientras que los casos de ALL a menudo mantienen núcleos redondos a ovoides y cantidades escasas de citoplasma (Figura 12).
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